Small RNA（包括miRNAs、SiRNAs和piRNAs等）是生命活动重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢紊乱及疾病发生和发展等生理过程中发挥重要作用。

miRNA是一类内源性的、长度约为18-25 nt的非编码RNA，通过与靶基因结合从而影响目标mRNA的稳定性或抑制其翻译，Small RNA测序不受物种限制，甚于二代测序技术可深度挖掘某组织在特定条件下18-35nt的 small RNA序列信息，既能鉴定已知的miRNA，也能预测发现新的miRNA。并可预测其靶基因对于动植物生长发育调控、寻找生物标记物、疾病发生发展等方面的研究具有重要意义。

「欧易生物优势」

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「技术应用」

• 探究病理或生理过程中的small RNA表达谱

• miRNA作为疾病诊断、预后和个性化治疗的新型的分子标志物（biomarker）

• miRNA在病理或生理中的功能机制研究

「分析内容」

「 结果展示」

「案例分享」

Engineered mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles for diabetic retinopathy therapy through HIF-1α/EZH2/PGC-1αpathway

工程间充质干细胞小细胞外囊泡通过HIF-1α/EZH2/PGC-1α通路治疗糖尿病视网膜病变

发表期刊：Bioactive Materials | IF：18.9 | 实验材料：外泌体

研究内容

糖尿病视网膜病变（DR）是失明的主要原因，治疗选择有限。间充质干细胞衍生的小细胞外囊泡（MSC-sEV）有望成为视网膜疾病的无细胞疗法。本研究建立了两种糖尿病模型，包括db/db小鼠和链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠，以评估MSC-sEVs在高血糖诱导的视网膜损伤中的治疗潜力。

研究表明，玻璃体内注射MSC-sEVs改善了两种糖尿病模型的视网膜功能并减轻了视网膜凋亡、炎症和血管生成。从机制上讲，高血糖诱导的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的激活抑制了TRIM21介导的泛素化和EZH2增强子的降解，最终通过EZH2诱导的甲基化修饰导致PGC-1α的下调。Small RNA测序结果表明，MSC-sEV中miR-5068和miR-10228靶向HIF-1α/EZH2/PGC-1α通路。阻断miR-5068和miR-10228可消除MSC-sEV的视网膜治疗作用。

此外，作者通过工程设计了一种高miR-5068、miR-10228水平的MSV-sEVs，进一步提高了视网膜修复效率。总之，本研究结果为DR进展的机制提供了新的见解，并强调了MSC-sEVs，特别是工程MSC-sEVs作为DR治疗选择的潜力。

图 | MSC-sEVs传递的miR-5068和miR-10228靶向HIF-1α/EZH2/PGC-1α通路

「案例分享」

Magnesium-containing bioceramics stimulate exosomal miR-196a-5p secretion to promote senescent osteogenesis through targeting Hoxa7/MAPK signaling axis

含镁生物陶瓷通过靶向Hoxa7/MAPK信号通路刺激外泌体miR-196a-5p分泌以促进老化骨再生

发表期刊：Bioactive Materials | IF：18.9 | 实验材料：外泌体

研究内容

干细胞衰老的特点是进行性功能障碍和分泌表型改变，包括增殖减少，成骨和血管生成分化功能障碍，衰老相关分泌表型（SASP）分泌增加，给骨修复带来困难。挽救或延缓老化骨髓间充质干细胞（O-BMSCs）的衰老被认为是衰老微环境下骨再生的有效策略。据报道，从生物陶瓷中释放的镁离子通过促进成骨和减轻衰老来促进骨再生。本研究以含镁离子的Akermanite biocreics（Akt）为模型，在体外通过激活MAPK信号通路促进O-BMSCs的成骨和血管生成作用。此外，增强的成骨作用可能归因于含镁-Akt提高了外泌体中miR-196a-5p的含量，并靶向Hoxa7基因和激活MAPK信号通路。体内研究证实，3D打印多孔含镁Akt支架可有效促进老年大鼠颅骨缺损的骨再生。

以上结果表明，外泌体miR-196a-5p/Hoxa7/MAPK信号轴可能是含镁-Akt介导成骨的潜在机制。Akt生物陶瓷或其他生物材料中释放的镁离子刺激外泌体介导的治疗，可能作为老年人骨修复的候选策略。

图 | 外泌体miR-196a-5p参与Akt-exo介导的O-BMSCs成骨

「送样指南」

样本采集与处理

• 样品类型：细胞、新鲜组织或RNA样品

• 细胞样品：培养诱导结束后，去除培养液，用PBS清洗后加入适量的专门的细胞裂解液，投入液氮冷冻，然后于液氮中存放或转入-80°C超低温冰箱保存

• 全血样本：方法1：分离白细胞后，加入适量专门的细胞裂解液，投入液氮冷冻，然后于液氮中存放或转入-80° C超低温冰箱保存；方法2：BD PAXgene Blood RNA Tube（BD静脉真空采血管；全血RN管）采血后，颠倒混匀8-10次。样本于4℃放置过夜后，转入-20℃或-80℃冰箱中保存，干冰运输

• 动物组织准确切取所需组织后，在RNase-free的生理盐水中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物。用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。后于液氮中存放或转入-80°C超低温冰箱保存

•  临床标本准确切取所需组织后，用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，立即投入液氮冷冻。后于液氮中存放或转入-80°C超低温冰箱保存植物组织准确取得所需组织后，立即放入进口冻存管中，投入液氮冷冻，然后于液氮中存放或转入-80° C超低温冰箱保存

「常见问题」

1、miRNA 测序对样品有什么要求？

为防止小RNA丢失，提取总RNA时请不要使用过柱法和LiCl沉淀法。建议在送样前，先使用OD值检测和电泳等方法对样品进行初步检测。

2、生物学重复是必须的吗？一般要重复几次？

是的。一般应该重复3次以上，具体情况需要根据具体实验来决定。样本数量越多统计学意义越大。

3、miRNA数据库有哪些？

常用的miRNA数据库包括miRBase、PMRD等。miRBase是目前最为重要的miRNA数据库之一。该数据库不仅能够提供miRNA检索，还可以通过链接microRNAorg、TargetScan、Pictar等网站进行靶基因的预测。目前miRBase已升级至22版本，囊括了271个物种的miRNA。

4、miRNA进行RT-PCR验证时出现非特异性扩增，如何解决？

因为miRNA序列比较短，相似度又非常高，尤其是同一家族的miRNAs，彼此间很难区分开，出现非特异性扩增是很正常的，建议使用Taqman探针法进行尝试。