4D-label free定量蛋白组学技术
蛋白质非标记定量技术(Label-free)是一种不依赖于同位素标记的蛋白质定量技术，该技术通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行 质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标签，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样本中相应肽段的信号 强度，就能对相应的蛋白质进行相对定量。
4D-label free蛋白质组学是基于tims TOF Pro离子淌度平台的新一代非标记蛋白组学技术，依靠双Tims和PASEF的数据采集模式 ，将数据依赖采集（DDA）与同步累积连续碎裂（PASEF）相结合，外加第四维度的离子淌度分离，提高离子利用率和鉴定精准度， 以更少上样量、更快扫描速度，实现蛋白质组学在覆盖深度、灵敏度、通量方面的全面性提升。
技术优势
无需昂贵的同位素标签标记，实验耗费低
基于高性能Tims TOF Pro 质谱仪，提高定量的准确性、鉴定深度，鉴定数量；
前处理操作过程较少，使样本最接近原始状态，同时不受样品条件限制
更低的样本量，适合微量样本检测
技术流程
应用方向
医学
疾病机制研究、疾病标志物发现、药物靶点筛选
植物
抗逆胁迫机制、生长发育机制，育种保护研究等
畜牧业
模式动物机制研究、家畜疾病研究等
食品环境
工程菌改造、病原微生物-宿主相互作用研究等
产品介绍
4D-DIA技术：基于捕获离子淌度的TimsTOF pro质谱仪，蛋白质组学技术正式进入扫描速度、检测灵敏度、鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能全面提升的4D时代。
TIMS（trapped ion mobility spectrometer）是一种离子淌度分析仪，其中离子在气流的推动下向前运动，将离子按大小和形状分开，在离子运动的反方向施加电场，阻滞离子的运动，将离子捕获在特定的位置，然后逐渐降低电场，将离子由大到小逐个释放。在TIMS-四极杆-TOF结构的系统中，离子淌度分离可以与四极杆质量选择同步，这种方法被称为平行累积连续碎裂（parallel accumulation–serial fragmentation, PASEF）。将PASEF原理扩展到DIA，将结合DIA数据采集方法的优点和PASEF的固有效率强强联合。
技术特色
低峰度蛋白检出率50%：DIA-数据非依赖性采集模式，保证了蛋白数据的完整性和重现性
4D全方位护航：保留时间：M/Z、峰强度、CSS（离子淌度）
提升灵敏度：4D-DIA在时间和空间聚集，极大提升了灵敏度，利于低丰度蛋白的检出
EVOSEP One&TimsTOF pro强强联合：更少的进样量，更短梯度、得到更深度的覆盖
PTM鉴定的强力支持：TimsTOF pro的淌度分离为PTM鉴定提供了更强有力的支持
更快：快速的扫描速度，为真正的高通量保驾护航
图 diaPASEF采集方法
（a）使用DDA、DIA以及diaPASEF方法获得的双电荷DLGEEHFK肽前体的y6离子的提取碎片离子色谱图
（b）在通过DDA，DIA和两种diaPASEF方案获得的200 ng HeLa酶切产物的单次运行分析中，从多电荷母离子中检测到的离子电流
（c）b中的累积离子电流
实验原理
在timsTOF Pro仪器（Bruker Daltonik）中，通过液相色谱分离的肽被离子化，引入质谱仪中并立即被捕获在双TIMS设备中。淌度分离的离子到达正交加速器，快速的TOF脉冲产生高分辨率的质谱图（在整个质量范围内，分辨率>35,000）。
与其他DIA采集方案相比，此功能可用于隔离DIA的母离子（肽段）质量窗口，而不会丢失各个质量窗口外的离子。鉴于低迁移率（通常为高m/z）离子被捕获在TIMS出口附近，它们首先被释放，因此质量选择四极杆必须首先定位在高m/z位置。随着更高迁移率（通常是降低的m/z）离子从TIMS依次释放，四极杆质量隔离窗口应向下滑动以降低m/z值以完全传输离子云。为了逼近理想的diaPASEF扫描，可根据TIMS斜坡时间逐步调整了隔离窗口，涵盖了2+和3+电荷状态的绝大多数母离子。每个DIA窗口中的碎片离子都是在母离子的精确离子淌度位置处检测到的。
图 新一代4D-蛋白质组学示意图
应用领域
疾病机制研究
临床biomarker筛选
疾病分子分型及分子分期
药物靶点筛选
药效毒理研究
实验原理
iTRAQTM试剂在结构上包括3个化学基团，分别是报告基团、平衡基团和反应基团。（如下图1）
iTRAQ技术的特点
1：通量高
可一次性分析4、8个样品
2：重复性好
所有样品的分离鉴定条件一致
3：数据丰富
可获得所有蛋白的定性和定量信息
4：自动化程度高
以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快
5：定量准确
减少了样本处理、以及不同组上机造成的实验误差，因此能达到定量更准确的效果
6：灵敏度高
可检测到表达丰度为皮克（pg)级的蛋白，无高丰度蛋白样本（血液、脑脊液、肌肉组织、骨组织等）可检测
实验流程
注：以iTRAQ 8标为例
样本类型及含量要求
| 1 | 蛋白质提取物 | 浓度>1μg/μg（建议为4μg/μg）蛋白总量>300μg |
| 2 | 细胞样品 | 细胞量>107个 |
| 3 | 组织样品 | 动物组织>100mg；植物物质>200mg |
| 4 | 液体样本 | 血液体积>100μg,尿液>10ml，唾液>1ml |
送样要求
1
在允许的条件下，实际样品准备量应适当比样品起始量多准备一些。
2
收集样品时做好分装标记，并尽快放在液氮中冻存或转移至-80度冰箱长期保存，避免反复冻融。远距离寄样时建议用顺丰运输。
3
生物学重复的样品一定要标记清楚，建议可以用：-1、-2、-3的方式来标记。
服务流程
实验原理
反应基团特异与肽段的氨基发生共价结合反应，将TMT试剂连接到肽段上。在一级图谱中，不同样品的来源于同一个蛋白质的同一个肽段由于被连接上总质量相同的完整TMTTM试剂而表现为一个峰。但在碰撞室内，平衡基团会发生中性丢失，而报告基团则会产生相应的报告离子。这些报告离子的强度就代表了相应样品蛋白质/肽段的强度，实现了对实现了对16及以内不同样本的同时定量同时定量。
TMT技术特点
1：通量高
可一次性分析6、10、16个样品
2：重复性好
所有样品的分离鉴定条件一致
3：数据丰富
可获得所有蛋白的定性和定量信息
4：自动化程度高
以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快
5：定量准确
减少了样本处理、以及不同组上机造成的实验误差，因此能达到定量更准确的效果
6：灵敏度高
可检测到表达丰度为皮克（pg)级的蛋白，无高丰度蛋白样本（血液、脑脊液、肌肉组织、骨组织等）可检测
实验流程
注：以TMT 6标为例
样本类型及含量要求
| 1 | 蛋白质提取物 | 浓度>1μg/μg（建议为4μg/μg）蛋白总量>300μg |
| 2 | 细胞样品 | 细胞量>107个 |
| 3 | 组织样品 | 动物组织>100mg；植物物质>200mg |
| 4 | 液体样本 | 血液体积>100μg,尿液>10ml，唾液>1ml |
送样要求
1
在允许的条件下，实际样品准备量应适当比样品起始量多准备一些。
2
收集样品时做好分装标记，并尽快放在液氮中冻存或转移至-80度冰箱长期保存，避免反复冻融。远距离寄样时建议用顺丰运输。
3
生物学重复的样品一定要标记清楚，建议可以用：-1、-2、-3的方式来标记。
仪器设备
Thermo Q-Exactive高分辨质谱
服务流程
服务流程
常见问题
Q1. iTRAQ / TMT 定量蛋白质组和双向电泳技术相比，有什么优势？
