标记定量蛋白质组学-欧易生物

4D-label free定量蛋白组学技术

蛋白质非标记定量技术(Label-free)是一种不依赖于同位素标记的蛋白质定量技术，该技术通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标签，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样本中相应肽段的信号强度，就能对相应的蛋白质进行相对定量。

4D-label free蛋白质组学是基于tims TOF Pro离子淌度平台的新一代非标记蛋白组学技术，依靠双Tims和PASEF的数据采集模式，将数据依赖采集（DDA）与同步累积连续碎裂（PASEF）相结合，外加第四维度的离子淌度分离，提高离子利用率和鉴定精准度，以更少上样量、更快扫描速度，实现蛋白质组学在覆盖深度、灵敏度、通量方面的全面性提升。

技术优势

无需昂贵的同位素标签标记，实验耗费低

基于高性能Tims TOF Pro 质谱仪，提高定量的准确性、鉴定深度，鉴定数量；

前处理操作过程较少，使样本最接近原始状态，同时不受样品条件限制

更低的样本量，适合微量样本检测

技术流程

4D-label free蛋白组学

应用方向

医学

疾病机制研究、疾病标志物发现、药物靶点筛选

植物

抗逆胁迫机制、生长发育机制，育种保护研究等

畜牧业

模式动物机制研究、家畜疾病研究等

食品环境

工程菌改造、病原微生物-宿主相互作用研究等

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产品介绍

4D-DIA技术：基于捕获离子淌度的TimsTOF pro质谱仪，蛋白质组学技术正式进入扫描速度、检测灵敏度、鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能全面提升的4D时代。

TIMS（trapped ion mobility spectrometer）是一种离子淌度分析仪，其中离子在气流的推动下向前运动，将离子按大小和形状分开，在离子运动的反方向施加电场，阻滞离子的运动，将离子捕获在特定的位置，然后逐渐降低电场，将离子由大到小逐个释放。在TIMS-四极杆-TOF结构的系统中，离子淌度分离可以与四极杆质量选择同步，这种方法被称为平行累积连续碎裂（parallel accumulation–serial fragmentation, PASEF）。将PASEF原理扩展到DIA，将结合DIA数据采集方法的优点和PASEF的固有效率强强联合。

技术特色

低峰度蛋白检出率50%：DIA-数据非依赖性采集模式，保证了蛋白数据的完整性和重现性

4D全方位护航：保留时间：M/Z、峰强度、CSS（离子淌度）

提升灵敏度：4D-DIA在时间和空间聚集，极大提升了灵敏度，利于低丰度蛋白的检出

EVOSEP One&TimsTOF pro强强联合：更少的进样量，更短梯度、得到更深度的覆盖

PTM鉴定的强力支持：TimsTOF pro的淌度分离为PTM鉴定提供了更强有力的支持

更快：快速的扫描速度，为真正的高通量保驾护航

4D-DIA产品介绍

图 diaPASEF采集方法

（a）使用DDA、DIA以及diaPASEF方法获得的双电荷DLGEEHFK肽前体的y6离子的提取碎片离子色谱图

（b）在通过DDA，DIA和两种diaPASEF方案获得的200 ng HeLa酶切产物的单次运行分析中，从多电荷母离子中检测到的离子电流

（c）b中的累积离子电流

实验原理

在timsTOF Pro仪器（Bruker Daltonik）中，通过液相色谱分离的肽被离子化，引入质谱仪中并立即被捕获在双TIMS设备中。淌度分离的离子到达正交加速器，快速的TOF脉冲产生高分辨率的质谱图（在整个质量范围内，分辨率>35,000）。

与其他DIA采集方案相比，此功能可用于隔离DIA的母离子（肽段）质量窗口，而不会丢失各个质量窗口外的离子。鉴于低迁移率（通常为高m/z）离子被捕获在TIMS出口附近，它们首先被释放，因此质量选择四极杆必须首先定位在高m/z位置。随着更高迁移率（通常是降低的m/z）离子从TIMS依次释放，四极杆质量隔离窗口应向下滑动以降低m/z值以完全传输离子云。为了逼近理想的diaPASEF扫描，可根据TIMS斜坡时间逐步调整了隔离窗口，涵盖了2+和3+电荷状态的绝大多数母离子。每个DIA窗口中的碎片离子都是在母离子的精确离子淌度位置处检测到的。

4D-DIA产品介绍

图新一代4D-蛋白质组学示意图

应用领域

疾病机制研究

临床biomarker筛选

疾病分子分型及分子分期

药物靶点筛选

药效毒理研究

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iTRAQ同位素标记定量技术

iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术是由美国应用生物系统公司AB研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量。

实验原理

iTRAQTM试剂在结构上包括3个化学基团，分别是报告基团、平衡基团和反应基团。（如下图1）

4plex iTRAQ分子结构

不同样品的同一肽段经iTRAQ试剂标记后具有相同的质量数，并在一级质谱检测（MS1）中表现为同一个质谱峰。当此质谱峰被选定进行碎裂后，在二级质谱检测（MS2）中，不同的报告基团被释放，它们各自的质谱峰的信号强弱，代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。

iTRAQ技术的特点

1：通量高

可一次性分析4、8个样品

2：重复性好

所有样品的分离鉴定条件一致

3：数据丰富

可获得所有蛋白的定性和定量信息

4：自动化程度高

以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快

5：定量准确

减少了样本处理、以及不同组上机造成的实验误差，因此能达到定量更准确的效果

6：灵敏度高

可检测到表达丰度为皮克（pg)级的蛋白，无高丰度蛋白样本（血液、脑脊液、肌肉组织、骨组织等）可检测

实验流程

注：以iTRAQ 8标为例

样本类型及含量要求

1	蛋白质提取物	浓度>1μg/μg（建议为4μg/μg）蛋白总量>300μg
2	细胞样品	细胞量>10⁷个
3	组织样品	动物组织>100mg；植物物质>200mg
4	液体样本	血液体积>100μg,尿液>10ml，唾液>1ml

送样要求

1

在允许的条件下，实际样品准备量应适当比样品起始量多准备一些。

2

收集样品时做好分装标记，并尽快放在液氮中冻存或转移至-80度冰箱长期保存，避免反复冻融。远距离寄样时建议用顺丰运输。

3

生物学重复的样品一定要标记清楚，建议可以用：-1、-2、-3的方式来标记。

仪器设备

Thermo Q-Exactive高分辨质谱

Sciex Triple TOF 6600质谱仪

服务流程

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TMT同位素标记定量技术

TMT（tandem mass tags）是由Thermo公司开发的一种体外标记技术，广泛用于差异表达蛋白质分析研究中。该技术采用多重同位素标签与肽段的氨基发生共价结合反应，可实现同时对不同样品中蛋白质的定性和定量分析（目前至多可实现同时标记16个样本）。

实验原理

反应基团特异与肽段的氨基发生共价结合反应，将TMT试剂连接到肽段上。在一级图谱中，不同样品的来源于同一个蛋白质的同一个肽段由于被连接上总质量相同的完整TMTTM试剂而表现为一个峰。但在碰撞室内，平衡基团会发生中性丢失，而报告基团则会产生相应的报告离子。这些报告离子的强度就代表了相应样品蛋白质/肽段的强度，实现了对实现了对16及以内不同样本的同时定量同时定量。

TMT技术特点

1：通量高

可一次性分析6、10、16个样品

2：重复性好

所有样品的分离鉴定条件一致

3：数据丰富

可获得所有蛋白的定性和定量信息

4：自动化程度高

以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快

5：定量准确

减少了样本处理、以及不同组上机造成的实验误差，因此能达到定量更准确的效果

6：灵敏度高

可检测到表达丰度为皮克（pg)级的蛋白，无高丰度蛋白样本（血液、脑脊液、肌肉组织、骨组织等）可检测

实验流程

注：以TMT 6标为例

样本类型及含量要求

1	蛋白质提取物	浓度>1μg/μg（建议为4μg/μg）蛋白总量>300μg
2	细胞样品	细胞量>10⁷个
3	组织样品	动物组织>100mg；植物物质>200mg
4	液体样本	血液体积>100μg,尿液>10ml，唾液>1ml

送样要求

1

在允许的条件下，实际样品准备量应适当比样品起始量多准备一些。

2

收集样品时做好分装标记，并尽快放在液氮中冻存或转移至-80度冰箱长期保存，避免反复冻融。远距离寄样时建议用顺丰运输。

3

生物学重复的样品一定要标记清楚，建议可以用：-1、-2、-3的方式来标记。

仪器设备

Thermo Q-Exactive高分辨质谱

服务流程

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DIA技术

数据非依赖采集（data independent acquisition，DIA）是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一。

DIA相比于DDA的优势在于可以测定复杂样品中丰度低的蛋白分子，大大提高了定量分析的可信度。其原理是在质谱数据采集时，高速、循环的将每个采集窗口内的所有母离子及其子离子碎裂后进行全扫描，而非根据母离子信号强度筛选后进行二级碎片再扫描[1, 2]。因此DIA具有高通量、高分辨率、高可重现性、定量准确等优点，而且样本无需分级上机，大幅缩短了每个样品的检测时间，适合大样本量的蛋白质组研究。但由于DIA获得的是几乎没有任何丢失的所有离子信息，数据量及其复杂性大大增加，数据分析难度加大。目前主流的数据分析是基于 DDA/DIA 构建的谱库和实验产生的数据对样品中的蛋白质进行鉴定和定量。公共的谱库可以从各大蛋白质组研究数据平台下载，但对于一些特异性的样本，为了有更好的鉴定结果，还需要通过实验样本建立DDA参考数据库。

实验原理

提取的蛋白酶解之后，利用液质联用技术对肽段进行质谱分析，通过比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。每条肽段的丰度（量）与其在质谱中的峰面积或信号强度成正比；而不同样品的同一条肽段在LC上的保留时间（retention time， RT）是一致的，因此，可以通过对比谱图库中的信息，再整合到相应蛋白，实现对蛋白质在不同样本中的相对表达水平的定量分析^{[1, 2]}。

技术的特点

（1）重现性好：采集所有离子及碎片谱图，不丢失任何信息；

（2）选择性好：基于碎片离子（即母子离子对）定量，与 SRM/MRM 相当；

（3）准确度高：循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高；

（4）通量高：同时监测所有目标蛋白/ 化合物，通量无上限；

（5）时效性强：对于易降解样品可以即刻采集，获得数据后再深入挖掘；

（6）数据易追溯：即使目前的水平无法发现某些蛋白/化合物，未来可以回溯；

实验流程

（1）从样本中提取蛋白并用BCA法或Brandford法进行蛋白的浓度测定；

（2）SDS-PAGE检测蛋白质完整度；

（3）每个样品取等量蛋白质进行酶解；

（4）对酶解后的肽段使用反向色谱柱，进行组分分离；

（5）加入混合标肽段（保留时间校正）；

（6）酶解后的多肽进行DDA建库，并对DDA建立库数据整理。。

（7）使用DIA模板，进行液相色谱串联高分辨质谱（LC-Orbitrap MS）采集，获得高质量DIA数据。

（8）对DIA数据进行处理，得到可信蛋白、筛选差异表达蛋白、差异蛋白生物信息学分析。

图 DIA操作流程

服务流程

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案例：由JAK2V617F变化引起的蛋白质组学分析

基本信息

材料：Ba/F3细胞系

主要技术：SILAC、iTRAQ

期刊：Leukemia.

影响因子：12.105

文章摘要

超90%的真红细胞增多症患者都存在JAK2，JAK2V617F的突变，这些突变基因的蛋白产物为临床治疗提供了重要的潜在靶点，但是目前JAK2抑制剂在临床治疗上并不成功。为了提高临床疗效和加深这些原癌基因在造血细胞中的作用，文章通过SILAC技术和iTRAQ技术检测到了受JAK2V617F基因影响的5000多种蛋白和2000多个核内磷酸化位，这些蛋白影响了p53和MYC信号通路，并通过JAK2V617F突变的临床病人的原代CD34+细胞进行了深入验证，同时抑制MYC和上调p53能够有效的清除JAK2V617F阳性的CD34+细胞，这为临床治疗提供了另一种思路。

方法流程

小鹿推荐

本文是通过蛋白质组学研究分子机理的典型文章。不同于一般研究的地方在于采用了两种标记蛋白质组学联合检测和分析，同时研究对象不局限于全细胞，还扩展至细胞核，检测的蛋白不局限于普通蛋白，同时也检测磷酸化修饰蛋白。着手点比较多，通过对数据的整合分析，层层递进，蛋白质组学研究方法可以很好满足此类研究的需求。

文献来源

Stella Pearson. et al., Proteomic analysis of JAK2V617F induced changes identifies potential new combinatorial therapeutic approaches. 2017, Leukemia.

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常见问题

Q1. iTRAQ / TMT 定量蛋白质组和双向电泳技术相比，有什么优势？

双向电泳技术是伴随着 MALDI-TOF 技术发展起来的蛋白质分离技术，理论上可以通过等电点（IEF）和分子量（SDS-PAGE）的差异将总蛋白质逐一分开。但实际情况并不理想，因为低丰度蛋白无法染色成功而看不见，蛋白翻译后修饰后偏离理论位置等等，一张 2-D胶能鉴定到的蛋白质总数至多1000 - 2000 蛋白。

相较于2-D以及 DIGE 等基于电泳的技术，iTRAQ / TMT 分辨率高，鹿明生物进行的细胞样品有发现超过 6000 个蛋白，并且大多数蛋白都有定量和定性信息；其次 iTRAQ/TMT 通量高，可以一次至多完成 8 或10个不同处理组的实验，特别适合于多组样品间的同时比较以及生物学过程的动态检测。

Q2. iTRAQ / TMT 实验的主要步骤有哪些，主要采用哪些仪器，检索的软件及常用数据库有哪些？

实验步骤包括：蛋白提取、浓度测定及 SDS-PAGE 凝胶检测，质检报告；蛋白酶解、标记；一维色谱分离，冻干机冻干；高分辨 LC-MS/MS 质谱检测；搜库定性、定量分析；差异蛋白筛选，差异蛋白生物信息学分析；完整报告整理。

目前鹿明生物的质谱仪器有：Sciex公司 6600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive、Fusion质谱仪。

常用的检索软件有：SCIEX公司ProteinPilot 5.0、Thermo 公司Proteome Discoverer。

常用的数据库有：Uniprot数据库、NCBI数据库、本地自建数据库。

Q3. iTRAQ、TMT、Label free 实验用的是什么质谱仪，其定量是基于一级质谱还是二级质谱？

iTRAQ、TMT、Label free都属于蛋白组学实验，前二者是属于同位素标记定量蛋白组二者的原理都一样；第三个是非标记定量蛋白组。三者所用的仪器都差不多，主要有：Sciex公司 5600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive；

PS: TMT 10标蛋白组只能用thermo公司Q Exactive，不能用AB 5600 做。 Itraq、TMT是基于二级质谱定量，Label free是基于一级质谱定量。

Q4. DIA技术有什么优势？

肽段覆盖率高、定量准确度高、实验重复性好；DIA技术的蛋白定量是基于二级质谱定量，相对于传统的Labelfree技术来说定量准确度更高；对比ITRAQ/TMT技术，DIA技术没有通量限制，可以同时对大样本量样品进行定性定量比较；DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测；DIA技术不需要昂贵的标记试剂，同时克服了标记效率对定量的影响；

Q5. DIA技术需要做技术重复么？

DIA技术需要至少三次生物学重复，特别是临床样本，重复越多越好。

Q6. DIA技术为什么需要重新建库，NCBI和uniport的数据库不能用么？

答：DIA本身是一种扫描的方式，我们常用的技术比如itraq/TMT、Labelfree等都是基于DDA的扫描方式，而且目前的数据库也只适合DDA扫描的出来的质谱数据，所以我们只能人工的建立一个数据库，才能供DIA的数据进行识别。

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