2024年1月9日，10x Genomics官方正式发布了空间转录组新品—Visium HD芯片，该芯片具有两个捕获区域，每个尺寸为6.5mm × 6.5mm，目前支持人和小鼠两个物种的FFPE石蜡样本检测。通过以2*2㎛的方格作为基础分析单位，Visium HD芯片能够实现高分辨率水平的空间转录组分析，可以无缝、无偏好地揭示生物组织内的基因表达情况，填补了10x Genomics在高分辨率空间转录组产品方面的空白，进一步提升了Visium平台的研究能力，这一发布也标志着10x Genomics空间转录组技术正式进入了高清时代。

最近，在大家的翘首企盼中，10x Genomics官方网站首次公开了多个样本的Visium HD的实测数据，那今天就让小编怀着激动的心情，带领大家一起来看一看Visium HD的真实数据效果吧（真实测试，包含部分下游分析结果）！

4个样本的实测数据链接如下：

（1）物种：人，组织：结直肠癌 (FFPE)，下载链接：https://www.10xgenomics.com/datasets/visium-hd-cytassist-gene-expression-libraries-of-human-crc

（2）物种：人，组织：肺癌 （FFPE），下载链接：https://www.10xgenomics.com/datasets/visium-hd-cytassist-gene-expression-libraries-of-human-lung-cancer-if

（3）物种：小鼠，组织：小肠 （FFPE），下载链接：https://www.10xgenomics.com/datasets/visium-hd-cytassist-gene-expression-libraries-of-mouse-intestine

（4）物种：小鼠，组织：脑组织 （FFPE），下载链接：https://www.10xgenomics.com/datasets/visium-hd-cytassist-gene-expression-libraries-of-mouse-brain-he

1. 基础质控

首先， 我们先来看一下在人类结直肠癌样本和肺癌样本中的主要质控指标参数，如表1所示。从测序质量来看， 2个样本的测序数据量分别为721 M和361 M Reads,  有效Barcodes占比在90%左右，有效UMI占比接近100%，而测序饱和度分别为56.51%和24.32%， 相对较低（其中肺癌样本数测序饱和度更低可能是受测序数据量的影响），表明从数据量上来讲2个样本均存在加测空间。从基因组比对及组织覆盖情况来看，2个样本比对到基因探针集上的Reads百分比也都接近100%，组织覆盖区域Squares捕获Reads百分比均达到了99%左右，检出基因的总数也分别达到了18,072和17,795，从侧面说明Visium HD产品的空间捕获能力和总基因捕获情况达到了预期。从不同Squares/Bins水平的基因和UMI检出数目来看，8㎛的Bins的组织覆盖区域的Bins数目分别为60.5万和54.6万，平均检出基因数分别为393和338, 平均检出UMI数分别为488和390， 以上各数据指标相对理想，可以平衡地兼顾分辨率和分析所需基因UMI情况 ，该水平也是10x官方推荐的可视化和分析的起始点。

表1 人类结直肠癌和肺癌样本质控指标

接下来，让我们来看一下2个小鼠样本的数据情况，如表2所示。 从测序质量来看， 类似于上面2个人的样本，2个小鼠样本的有效Barcodes占比和有效UMI占比均分布在90%和100%左右， 测序饱和度也相对较低，分别为45.99%和70.07%。从基因组比对及组织覆盖情况来看，2个小鼠样本基因探针集比对Reads占比也接近100%，组织覆盖区域Squares捕获Reads百分比均达到了98%左右，检出基因的总数也分别达到了19,029和18,991 。从不同Squares/Bins水平的基因和UMI检出数目来看， 8㎛ Bins的平均基因检出数分别为304和201，平均UMIs检出数分别为392和225，16㎛ Bins的平均基因检出数分别为966和690，平均UMIs检出数分别为1523和898。

表2 小鼠小肠和脑组织样本质控指标

2. 降维聚类

接下来，我们选取人的结直肠癌样本数据，采用Seurat包， 从8㎛ Bins（CRC08）和16㎛Bins（CRC16）水平，进行常见的下游分析。首先，我们统计了各个Bins中UMI数（nCount_Spatial），基因数（nFeature_Spatial），单位UMI内基因数目的比例（log10GenesPerUMI）以及线粒体比例（percent.mt）的分布情况，如图1所示。从结果来看，整体数据质量基本正常，线粒体比例也在可接受范围内。

图1 8㎛ Bins和16㎛ Bins数据各质控指标的小提琴图

接着利用Seurat软件，基于PCA主成分分析，对2个Bins水平数据进行降维聚类，并进行可视化，如图2所示。从8㎛ Bins的降维聚类的空间映射结果来看，聚类结果基本可以区分不同组织区域，不存在大范围的混杂情况，结果基本符合组织结构。

图2 人类结直肠癌8㎛ Bins数据降维聚类结果

16 ㎛ Bins的降维聚类结果也基本符合预期，如图3所示，可以看出除了部分区域区分不明显，大部分区域的分类情况与组织结构也基本相符。

图3 人类结直肠癌16㎛ Bins数据降维聚类结果

3. 特征基因鉴定及细胞类型判定

接下来，我们首先基于Seurat 中的FindAllMarkers函数，对每个clusters筛选出top10特征基因进行展示，如图4所示。我们可以观察到，在8㎛ Bins数据中，一些聚类簇的特征基因非常显著，比如成纤维细胞（COL1A1）、上皮细胞（MYC）、杯状细胞（MUC2，FCGBP）、浆细胞（IGHA1,IGHM）、单核巨噬细胞（APOE）。然而，在16㎛ Bins数据中，一些聚类簇的特征基因相对较少，比如cluster1，可能是16㎛ Bins的分辨率较低，单个Bins可能存在多个细胞，从而使得特征基因不明显，提示后续如果采用该分辨率水平进行下游分析，可能需要采用RCTD、cell2location等反卷积的方法来推断，以获得更为精细的结果。 

图4 每个cluster的top10特征基因热图。左图为8㎛数据结果，右图为16㎛数据结果

 根据特征基因， 我们以8㎛ Bins的结果为例， 对部分细胞类型的特征基因表达进行空间可视化展示， 如图5所示，可以看出细胞类型大类的空间分布基本与组织结构基本吻合，符合预期。

图5 部分细胞类型特征基因表达空间分布图