10x Visium HD作为基于原位捕获的空间转录组技术中分辨率最高的一个平台，目前可兼容的样本类型从单FFPE样本扩展到了可以同时实现FFPE样本和新鲜冰冻（FF）样本的分析。为了让各位老师能够更好的开展HD的FF样本实验，我们总结了从样本准备到Demo数据的一站式FF样本解决方案。
10x Visium HD平台介绍
传统10x Visium空间基因表达玻片上的spot是圆形的，两个spot之间存在自然形成的空隙。Visium HD玻片将带有空间位置标签的寡核苷酸排布在连续排列的数百万个无间隙的2x2µm正方形中，实现了无间隙捕获组织信息。同时，一张玻片上包含两个6.5x6.5mm 捕获区域，沿用了已有的基于10X CytAssist V2版本格式，且Visium HD平台捕获数目从5000个spot大幅提升到1100w个 square。
Visium HD芯片规格（图片来自10x Genomics官网）
样本准备
正确的组织处理、储存和制备流程可有效保持组织切片的形态质量和mRNA转录本的完整性。
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样本包埋
新鲜组织样本采集到后，尽量在5min中内将组织样本包埋在OCT中并放入干冰中速冻以保护组织结构。干冰速冻的过程中，需确保组织均匀受冻，且组织和OCT都需要完全冻结后，再做后续步骤。包埋好的样本可储存在-80°C冰箱，或用锡纸包裹，干冰寄送至公司。
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质检
1.RNA完整度检测：Visium HD对于FF样本的要求与CytAssist V2相同，为RIN>4，如果组织含有大量的结缔或脂肪组织，则质检的样本用量会有一定增加，约为50mg。
2.H&E：观察组织形态、结构是否符合预期。
Tips：两种情况会导致RIN值过低。第一，欠佳的样本准备流程；第二，样本类型为病变、坏死、缺血组织。
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切片厚度
10x对于大多数组织类型的建议切片厚度为10μm，脂肪含量较高的组织切片（如乳腺组织）需要20μm左右的厚度。
10×实测数据展示
目前Visium HD FF样本推荐数据量为700Mreads (210G)
1.10x已测试的样本类型
目前10x已对一系列的人、鼠FF样本进行了检测，具体信息参考下表。
Visium HD 人、鼠测试组织（数据来自10x Genomics官网）
2. 10x Visium HD人乳腺癌FF样本实测数据展示
基础信息：该数据是基于Space Ranger v3.1.1进行的分析，使用的探针集为Visium Human Transcriptome Probe Set v2.0，基于该探针集鉴定得到17527个基因。此次实验一共测的约747M条reads，映射到探针集的reads占总体的98.5%，测序饱和度为42.8%。
Visium HD人乳腺癌FF样本 web summary （数据来自10x Genomics官网）
不同精度下鉴定到的转录本数量和基因数量对比：
①在8μm（8μm*8μm）的矩阵精度下，每单位平方内平均鉴定得到的UMI数为772.8、基因数为550.3。
②在16μm（16μm*16μm）的矩阵精度下，每单位平方内平均鉴定得到的UMI数为3072.9、基因数为1714.5。
Visium HD人乳腺癌FF样本在不同精度下鉴定到的转录本数量和基因数量对比（数据来自10x Genomics 官网）
8μm精度下细胞降维聚类结果：通过UMAP降维，共获得10个细胞群，并且可以将这10个细胞群重新映射回组织的H&E染色结果当中，对聚类的结果有一个更加精准的分析判断。
Visium HD人乳腺癌FF样本在8μm精度下的分群聚类结果（数据来自10x Genomics 官网）
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