前言
小麦丰收前，如果遇上一场雨加上降温会让饱满的麦穗在母株上就提前发芽，这就是农业上令人头疼的穗发芽（Pre-harvest sprouting, PHS）现象。穗发芽会严重降低小麦产量、面粉品质，如何让小麦种子保持恰到好处的休眠，是育种家们长期攻关的课题。
近日，安徽农业大学马传喜研究团队于Plant Communications发表的题为“The TaDof-2D-miR1832-TaP450-7A module regulates low-temperature-induced seed dormancy release in wheat”研究论文，利用全转录组测序、酵母单杂交（Y1H）文库筛选、遗传转化等技术手段，完整揭示了低温诱导小麦种子休眠释放的TaDof-2D–miR1832–TaP450-7A级联调控通路，并开发了可直接用于分子育种的CAPS功能性标记。
欧易生物为本项目提供了酵母文库构建服务。
文库与诱饵
酵母文库：小麦种子cDNA文库
诱饵启动子：promoter of miR1832
筛选方法：酵母单杂交
验证方法：Y1H assay/EMSA/LUC
研究思路
研究结果
1.表型锁定：种子发育中后期的低温可诱导休眠解除
研究首先以强休眠小麦地方品种WTB为材料，在种子发育中后期（花后21至35天）分别进行常温（NT，25°C/20°C）和低温（LT，15°C/10°C）处理。结果显示，低温处理组的发芽率由常温下的0%骤升至100%（图1A–1C）。为进一步排除水分含量对休眠释放的干扰，研究者将低温处理后的种子自然晾干至与常温处理相同含水量（约12%），其发芽率仍维持在100%，从而证明了低温信号本身是解除休眠的主导因子。
同步生理测定表明，低温处理显著提高了种子内GA₁、GA₃含量及α-淀粉酶活性，同时降低了ABA含量（图1D–1F），初步锚定了激素平衡变化是休眠释放的生理基础。
图1. 低温诱导小麦种子休眠释放的表型、生理变化及全转录组调控网络鉴定
2.miR1832在调控低温诱导的休眠解除过程中发挥核心作用
为从分子层面系统解析调控网络，研究者对常温和低温处理的WTB种子进行了全转录组链特异性测序，涵盖mRNA、miRNA、lncRNA及circRNA四类RNA分子。在鉴定出的4862个差异表达基因与82个差异表达miRNA中，一个位于调控网络关键节点的新型miRNA——miR1832引起了研究者注意，其在低温处理下显著下调。通过构建miRNA–mRNA调控网络，miR1832展现出多层级hub节点特征，提示其在休眠调控中居于中枢地位（图1G）。RT-qPCR验证结果与测序数据高度吻合。
3.功能验证：常温下miR1832诱导种子休眠
为确定miR1832是否在正常温度（NT）条件下参与种子发育调控，研究者首先检测了其在不同品种种子发育阶段的表达模式。结果发现强休眠品种WTB和HMC21中miR1832表达水平显著高于弱休眠品种ZY9507和J411，暗示miR1832正调控种子休眠。为验证这一功能，研究构建了miR1832过表达和miR1832-STTM沉默的转基因小麦。发芽实验显示，过表达株系发芽率降至35%–47%（野生型为84%），休眠显著增强；而STTM株系发芽率升至95%–97%，休眠被明显释放，证明miR1832确实正向调控种子休眠，并且在水稻、拟南芥中也有相似结果（图2）。
进一步克隆启动子序列发现，强休眠品种在–670 bp处为A等位，保留Dof转录因子结合基序；弱休眠品种为G等位，基序缺失。基于此SNP开发的CAPS标记在160份品种中的关联分析表明，A等位与强休眠显著相关，G等位与弱休眠显著相关。群体遗传分析进一步揭示，A等位在124份地方品种中频率高达76.6%，而在245份现代改良品种中仅占1.6%（图2），表明1832-A等位基因在现代小麦育种中尚未得到充分利用，可能成为通过分子设计育种提升PHS抗性的重要靶点。
图2.miR1832可正向调控小麦种子的休眠状态
4.TaDof-2D直接结合于miR1832启动子中的A位点以抑制其转录
为进一步验证A/G变异的功能效应，研究者首先采用酵母单杂交（Y1H）技术，以携带A等位启动子片段（~90 bp）为诱饵，从小麦（强休眠品种HMC21）种子cDNA文库中筛选出35个阳性克隆（附图10），经测序鉴定出3个Dof家族转录因子：TaDof-2D、TaDof-3A和TaDof-4D。Y1H验证显示TaDof-2D等仅能结合A等位片段，而不能结合G等位（图3A–3B）。在此基础上，通过电泳迁移率变动分析（EMSA） 和双荧光素酶（dual-LUC）瞬时表达报告实验（图3C–3F），进一步验证了aDof-2D能够特异性结合含A基序的启动子片段，而无法结合G变体。低温处理上调TaDof-2D表达，进而抑制miR1832转录，解除其对下游靶标的沉默。转基因功能实验进一步佐证（图4）：在含A等位的WTB背景下过表达TaDof-2D（图4A–4C），显著降低miR1832表达并促进休眠释放；而在含G等位的Fielder背景下过表达（图4D–4F）或对J411背景进行EMS突变（图4G–4I），均未产生表型变化，充分说明TaDof-2D对miR1832的调控具有A等位依赖性。
图3.TaDof-2D可抑制miR1832的转录
图4.TaDof-2D诱导A等位种子打破休眠
5.TaP450-7A为miR1832直接靶标
为鉴定miR1832靶向的基因，研究者通过psRNATarget靶基因预测与转录组数据，筛选出三个候选靶基因。随后利用5'-RACE（cDNA末端快速扩增） 在TaP450-7A mRNA内部精确定位了miR1832的切割位点（图5A）。进一步构建携带TaP450-7A或抗miR1832切割的mTaP450-7A融合LUC报告载体，与miR1832效应载体共转化本氏烟草叶片（图5B–5C）。结果显示，miR1832能够显著抑制TaP450-7A-LUC活性，而对引入同义突变的mTaP450-7A-LUC则无抑制作用（图5D–5E），从体内水平直接证实了miR1832对TaP450-7A的靶向切割与表达调控功能。通过遗传转化进一步证明该基因可显著提高种子发芽率（图5F-H）。
图5.TaP450-7A为miR1832直接靶标及功能验证
6.模块建立：TaDof-2D–miR1832–TaP450-7A通过调节α-淀粉酶活性及ABA/GA信号通路，促进低温诱导的休眠解除
为解析模块的下游生理机制，研究者测定了转基因种子中GA/ABA含量及α-淀粉酶活性。结果显示，miR1832过表达种子中GA₁/GA₃及其中间产物显著降低、ABA含量升高、α-淀粉酶活性下降，且GA合成/信号及ABA分解相关基因呈全局性抑制；而TaP450-7A过表达呈现完全相反趋势。最终提出完整工作模型：低温→诱导TaDof-2D→结合A等位抑制miR1832转录→解除对TaP450-7A的靶向切割→上调GA合成与ABA分解、激活α-淀粉酶→打破ABA/GA平衡→驱动休眠释放。
研究总结
图6. 低温诱导种子休眠解除的分子机制
本研究发现，小麦种子发育中后期低温诱导TaDof-2D表达。该转录因子直接结合miR1832启动子中的休眠相关A等位基因并抑制其转录，进而减弱miR1832对细胞色素P450基因TaP450-7A的切割效应。TaP450-7A表达升高后，通过上调ABA分解代谢、GA生物合成及α-淀粉酶合成相关基因，同时下调ABA信号传导和α-淀粉酶抑制相关基因，改变ABA/GA平衡并提高α-淀粉酶活性，最终解除种子休眠。这一发现从分子层面，解释了“低温为何会让小麦种子提前苏醒”的疑问，同时提供了让种子在合适时间苏醒的技术策略，基于这种低温处理方法，还能缩短育种周期、加快小麦育种进程。
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.xplc.2026.101749
安徽农业大学为本文第一单位，农学院博士后高威和硕士研究生崔子恒（现已毕业）为论文共同第一作者。农学院张海萍教授、常成教授以及阮勇凌教授为该论文共同通讯作者。马传喜教授指导了该项工作。该研究得到了国家自然科学基金（32372069，U20A2033）、江苏省现代农业协同创新中心（JCIC-MCP）以及安徽省小麦产业技术体系（AHCYTX-02）的资助。