肝细胞癌（HCC）是全球癌症死亡第三大原因，在我国位居癌症死亡第二位。多数患者因肿瘤转移而失去初次手术机会，五年生存率不足20%，肺是最常见的远处转移部位。肿瘤细胞的转移过程高度依赖能量供应，线粒体作为细胞代谢枢纽，通过代谢重编程为肿瘤生长与播散提供能量支持，成为驱动HCC进展的关键风险因素。健脾化瘀汤（JPHYD）是广州中医药大学第一附属医院临床治疗HCC的有效经验方，已在临床中显示抑制转移、改善预后的效果，但其分子机制尚未阐明。

2026年6月，广州中医药大学第一附属医院钟崇团队在 Phytomedicine（IF 11.3）发表题为"Jianpi Huayu decoction suppresses hepatocellular carcinoma invasion and metastasis by inhibiting SIRT5-regulated Nrf2 activation and mitochondrial metabolic reprogramming"的研究论文。该研究通过整合DIA蛋白质组学、网络药理学、分子对接/分子动力学模拟与体内外功能验证等技术体系，在 HCCLM3 皮下异种移植模型与 H22 实验性肺转移模型中证实健脾化瘀汤（JPHYD）显著抑制肝癌生长与肺转移，并鉴定出去乙酰化酶 SIRT5 为其核心功能靶点：JPHYD 下调 SIRT5 表达、破坏 SIRT5/Nrf2 蛋白互作，抑制 Nrf2 核转位及下游抗氧化蛋白（NQO1、HO-1）表达，导致 ROS 累积、线粒体功能障碍与 ATP 合成减少，最终诱导凋亡并抑制 EMT；SIRT5 过表达可部分逆转上述效应。该研究进一步从复方中锁定人参皂苷 Rb3 为靶向 SIRT5 的核心活性成分，为肝癌的精准干预提供了新靶点与候选先导化合物。

【欧易生物为本研究提供 UPLC-Q-Orbitrap HRMS 中药复方成分鉴定技术服务（基于 LuMet-TCM 中药专属标准物质数据库）和DIA蛋白质学技术服务】

1. UPLC-Q-Orbitrap HRMS 成分分析锁定人参皂苷 Rb3 等四大核心成分

为系统表征健脾化瘀汤（JPHYD）的化学物质基础，团队采用 UPLC-Q-Orbitrap 高分辨质谱对复方水提物进行成分分析，在正、负离子模式下采集基峰色谱图（BPC），并基于欧易生物 LuMet-TCM 中药专属标准物质数据库进行定性鉴定，锁定人参皂苷 Rb3、甘草次酸单葡萄糖醛酸苷、丹参酮 I 与白术内酯 I 为复方四大核心成分；后续以 HPLC 指纹图谱与含量测定（10 批样品，相似度 0.962–0.991）进行质量控制，保证批次间质量稳定。

图1. JPHYD 水提物 UPLC-Q-Orbitrap HRMS 正（A）负（B）离子模式基峰色谱图及主要成分标注

2. JPHYD 显著抑制 HCCLM3 皮下移植瘤生长

为评估 JPHYD 的抗肿瘤药效，团队建立 HCCLM3 皮下异种移植模型（BALB/c-nu 小鼠），设空白对照、JPHYD 低/中/高剂量（3.844、7.689、15.378 g/kg/d，灌胃）与顺铂阳性对照（3 mg/kg，腹腔注射），连续给药 3 周。结果显示，JPHYD 显著抑制皮下移植瘤的体积与重量，其中 3.844 g/kg/d 剂量效应较弱、未达统计显著；因此后续实验选用 7.689 与 15.378 g/kg/d 分别作为低、高剂量组。

图2. JPHYD 抑制 HCCLM3 皮下异种移植瘤生长

3. DIA蛋白质组学联合网络药理学锁定 SIRT5/Nrf2 轴为核心靶点

为锁定 JPHYD 的分子靶点，团队对 JPHYD 处理后的移植瘤组织进行DIA蛋白质组学分析，筛选出 301 个差异表达蛋白，其中SIRT5 在 JPHYD 处理组中显著下调。GO/KEGG/Reactome/WikiPathways 富集分析一致指向线粒体电子传递、ATP 合成、氧化磷酸化（OXPHOS）与活性氧（ROS）通路。进一步整合网络药理学（TCMSP 药物靶点 432 个、GeneCards/OMIM 疾病靶点 11336 个），将蛋白组差异蛋白、药物靶点与疾病靶点三方取交，仅得 SIRT5、NFKBIA 与 SLC2A4 三个共同基因；STRING–Cytoscape 构建的 PPI 网络中，SIRT5、Nrf2（NFE2L2）及其下游 NQO1、HMOX1，以及凋亡相关 BAX、BCL2、CASP3/8/9 均为关键枢纽节点，提示 SIRT5/Nrf2–NQO1/HO-1 轴是 JPHYD 抗肝癌效应的核心机制候选。

图3. 蛋白质组学揭示 JPHYD 下调 SIRT5 并抑制 OXPHOS/ROS 通路

图4. 蛋白质组学联合网络药理学揭示抗 HCC 机制

4. JPHYD 经抑制 SIRT5/Nrf2 通路抑制 ATP 产生、诱导凋亡并延缓 EMT

为在体内验证上述机制，团队对移植瘤组织进行免疫组化与 Western blot 检测，确认 JPHYD 显著下调 SIRT5 及其下游 Nrf2、抗氧化蛋白 NQO1 与 HO-1 的表达；氧化应激标志物 MDA 降低、SOD 升高；ATP 水平显著下降。TUNEL 染色显示 JPHYD 诱导肿瘤细胞凋亡，Western blot 显示促凋亡蛋白 BAX 上调、抗凋亡蛋白 BCL-2 下调。同时，间充质标志物 Vimentin 下调、上皮标志物 E-cadherin 上调，提示 EMT 进程被有效抑制。上述结果提示，JPHYD 通过抑制 SIRT5/Nrf2 通路削弱肿瘤细胞抗氧化能力与能量供给，从而诱导凋亡并抑制 EMT。

图5. JPHYD 体内经 SIRT5/Nrf2 通路抑制 ATP 产生、诱导凋亡并延缓 EMT

5. JPHYD 含药血清剂量依赖地抑制 HCC 细胞增殖与侵袭

为评估 JPHYD 的体外药效，团队以 JPHYD 含药血清处理 HCCLM3 与 HepG2 细胞。结果显示细胞活力呈浓度依赖性下降。EdU、划痕愈合与 Transwell 迁移/侵袭实验一致显示，JPHYD 含药血清剂量依赖地抑制两种肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力。

图6. JPHYD 含药血清剂量依赖抑制 HCC 细胞增殖与侵袭

6. JPHYD 含药血清破坏 SIRT5/Nrf2 互作、阻断 Nrf2 核转位并诱导线粒体氧化应激

为阐明 JPHYD 调控 SIRT5/Nrf2 轴的具体方式，团队结合临床队列分析、分子对接及互作与定位检测进行验证。结果显示，在TCGA-LIHC 队列中 SIRT5 与 Nrf2 表达呈显著正相关，分子对接显示二者具有强结合亲和力。JPHYD 含药血清显著破坏 SIRT5 与 Nrf2 的蛋白互作；JPHYD 下调 Nrf2 总表达并抑制其核转位，从而削弱 Nrf2 介导的抗氧化防御。功能层面，JPHYD 含药血清显著降低线粒体膜电位（ΔΨm），免疫荧光与流式细胞术检测到 ROS 累积，ATP 水平明显下降；Western blot 同步显示 NQO1/HO-1 下调、BAX 上调/Bcl-2 下调、E-cadherin 上调/Vimentin 下调。上述结果提示，JPHYD 通过破坏 SIRT5/Nrf2 互作、阻断 Nrf2 核转位，经线粒体氧化应激诱导凋亡并抑制侵袭转移。

图7. JPHYD 含药血清经线粒体氧化应激诱导凋亡并抑制侵袭转移

图8. JPHYD 含药血清破坏 SIRT5/Nrf2 互作并阻断 Nrf2 核转位

7. SIRT5 过表达部分逆转 JPHYD 的抗 HCC 效应

为确证 SIRT5 是 JPHYD 抗肝癌作用的功能中介，团队在 HCCLM3 与 HepG2 细胞中瞬时过表达 SIRT5。EdU、划痕愈合与迁移/侵袭实验显示，SIRT5 过表达显著逆转了 JPHYD 含药血清对细胞增殖、迁移与侵袭的抑制；在机制层面，SIRT5 过表达亦部分逆转 JPHYD 诱导的线粒体膜电位下降、ROS 累积与 ATP 减少，并使 NQO1/HO-1、凋亡相关蛋白与 EMT 标记物的变化向致癌方向回复。上述回补结果确证，JPHYD 的抗肝癌效应依赖其对 SIRT5 的靶向抑制。

图9. SIRT5 过表达部分逆转 JPHYD 对 HCC 细胞增殖与侵袭的抑制

图10. SIRT5 过表达部分逆转 JPHYD 诱导的线粒体氧化应激与凋亡

8. JPHYD 显著抑制 HCC 肺转移

为评估 JPHYD 的抗转移能力，团队构建 H22 肝癌细胞尾静脉注射的实验性肺转移模型。活体成像显示，JPHYD 处理组荧光信号强度较对照组显著降低；解剖观察可见肺表面转移性白结节呈剂量依赖性减少；H&E 染色证实治疗组肺转移灶明显缩小、坏死区增多。分子层面，JPHYD 显著下调肺组织中 SIRT5、Nrf2 及下游抗氧化蛋白 NQO1、HO-1 的表达，MDA 降低、SOD 升高，ATP 水平下降，TUNEL 阳性凋亡细胞增多（BAX 上调、BCL-2 下调），并促进 E-cadherin、抑制 Vimentin 表达。上述结果表明，JPHYD 通过靶向 SIRT5/Nrf2 通路引发线粒体功能障碍与氧化应激，诱导凋亡并抑制 EMT，从而显著抑制 HCC 肺转移。

图11. JPHYD 显著抑制 H22 肺转移

9. 分子对接、分子动力学与 CETSA 证实人参皂苷 Rb3 为靶向 SIRT5 的核心活性成分

为锁定复方中靶向 SIRT5 的核心活性成分，团队将 HRMS 鉴定出的成分与 SIRT5 进行分子对接，结果显示Rb3 结合亲和力最强。100 ns 分子动力学模拟显示 SIRT5–Rb3 复合物整体稳定、构象紧凑且相互作用持续；CETSA 实验证实 Rb3 处理显著增强 SIRT5 的热稳定性，提示二者存在直接结合。功能上，Rb3 在 12.5、25、50 μM 剂量下抑制 HCC 细胞增殖、迁移与侵袭，降低线粒体膜电位、增加 ROS 并减少 ATP，同时下调 SIRT5 与 Nrf2 表达。上述结果表明，人参皂苷 Rb3 是 JPHYD 靶向 SIRT5/Nrf2 通路的核心活性成分之一。

图12. 分子对接揭示 Rb3 等四核心成分与 SIRT5 强结合

图13. 分子动力学与 CETSA 证实 Rb3 直接结合 SIRT5

本研究通过DIA蛋白组学联合网络药理学，系统阐明健脾化瘀汤（JPHYD）抑制HCC侵袭转移的分子机制：JPHYD破坏SIRT5/Nrf2蛋白互作，抑制Nrf2核转位及其下游抗氧化蛋白（NQO1/HO-1），引发ROS积累、线粒体功能障碍与OXPHOS抑制，造成能量危机并诱导凋亡、抑制EMT，最终抑制肿瘤生长与肺转移；人参皂苷Rb3为靶向SIRT5的核心活性成分（分子对接+分子动力学+CETSA三重验证）。SIRT5/Nrf2轴有望作为JPHYD疗效预测生物标志物与HCC治疗新靶点，该研究为中药复方多成分协同治疗晚期HCC提供了科学依据。

本文亮点：

① DIA蛋白组学联合网络药理学"三方交集+PPI枢纽"策略，精准锁定SIRT5为复方核心靶点，体现多组学与计算药理学结合的方法学优势；

② 首次阐明JPHYD通过破坏SIRT5/Nrf2互作、阻断Nrf2核转位来抑制线粒体代谢重编程的完整机制，并以SIRT5过表达回补实验完成因果验证；

③ 分子对接+分子动力学+CETSA三重验证人参皂苷Rb3为靶向SIRT5的核心成分，实现"复方-成分-靶点"贯通，符合中医"君臣佐使"配伍理论。

组学检测价值：

本研究依托DIA蛋白组学平台完成全蛋白组定量与差异蛋白筛选，并经GO/KEGG/Reactome/WikiPathways多数据库富集锁定OXPHOS与ROS通路；UPLC-Q-Orbitrap HRMS成分鉴定借助欧易生物LuMet-TCM中药标准品数据库（中药专属标准品库，Level 1置信度）实现复方化学成分精准注释。DIA蛋白组学+中药成分数据库联合策略，可高效支撑中医药机制研究、复方质量控制与成分-靶点关联分析，是中药复方药效机制类文章的高价值技术组合。