2020年10月8日，武汉协和医院陈朝晖教授、谌科教授于Nature Communications（IF：12.121）在线发表了膀胱癌单细胞测序的新研究成果。对8例膀胱癌肿瘤样本和3例配对癌旁样本进行了10x Genomics高通量单细胞转录组测序，绘制了膀胱癌肿瘤微环境细胞图谱，强调了肿瘤相关成纤维中iCAFs亚群（inflammatory cancer-associated fibroblasts）的作用并提出了膀胱癌治疗的潜在靶点。

欧易生物提供了该项目的单细胞转录组测序实验和分析工作。下面，我们就一起学习这篇文章的研究内容。
 

研究背景

膀胱癌是世界上常见的泌尿生殖系统恶性疾病之一，每年约有430,000新诊断病例和超过165,000的死亡病例。尽管膀胱癌治疗手段已经取得了长足的进展，但膀胱癌患者的临床疗效仍不令人满意。膀胱癌是不具免疫浸润性的肿瘤之一，这可能是抗PD1治疗效果不佳的原因。肿瘤微环境与肿瘤治疗靶点密切相关，本研究旨在利用单细胞测序解析膀胱癌肿瘤微环境特征，为临床中膀胱癌免疫治疗新方案的研发提供数据支持。
 

基本信息

标题：Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma
期刊：Nature Communications
影响因子：12.121
发表年月：2020年10月
材料：8例膀胱癌肿瘤样本（2例低级别和6例高级别）和3例配对癌旁样本
方法：10x Genomics高通量单细胞转录组测序（由欧易生物提供技术支持）

研究结果

1. 细胞类型鉴定

结果共获得52,721个单细胞进行下游分析。通过tSNE降维聚类和已知的细胞类型marker，将细胞聚成了8个主要的cluster，包括：epithelial cells（EPCAM+）、endothelial cells（CD31+）、B cells（CD79A+）、myeloid cells（LYZ+）、T cells（CD3D+）、mast cells（TPSAB1+）和2群fibroblasts（PDGFRA+iCAFs和RGS5+mCAFs）（Figure 1A-1B）。
 

2. Epithelial cells特征分析

通过InferCNV分析，作者发现CNV主要存在于高级别肿瘤组epithelial cells中，其中9号染色体和11号染色体有明显缺失，19号染色体和20号染色体出现扩增。根据CNV level的不同，作者将pithelial cells划分为四类：正常对照组epithelial cells、低CNV level epithelial cells、高CNV level epithelial cells和无CNV level检出的epithelial cells（Figure 1D）。

差异基因富集分析结果发现，肿瘤细胞低表达MHC-II类分子，高表达E2F targets和MYC targets等条目，表明肿瘤细胞具有较强的增殖能力并可能通过下调免疫原性逃避免疫系统识别和攻击（Figure 1E-1H）。

图1 细胞类型鉴定和epithelial cell进一步降维聚类分析结果
 

3. Myeloid cells特征分析

图2 Myeloid cells降维聚类分析

作者通过进一步的降维聚类将myeloid cells分为了7个cluster，分别为：MRC1+C1high TAMs、CD1C+DCs、S100A8+S100A9+monocytes、TOP2A+myeloid cells、CLEC9A+cross-presenting DCs、follicular B cells和LAMP3+ DCs。其中monocytes主要存在于癌旁中，TAMs主要富集在肿瘤区域，两者的表达谱变化呈现连续变化趋势，表明monocytes可能招募到肿瘤区域并重编程为TAMs（Figure 2B-2C）。对monocyte向TAMs重编程轨迹进行SCENIC分析发现，BACH1、MAFG和NFE2 motif活性下调，MAF、STAT1和STAT2的motif活性升高（Figure 2C-2D），这可能是导致M2极化的原因。上述结果为改变免疫微环境的形成提供了潜在的靶点。

对DC亚群的分析发现，LAMP3+ DCs主要富集在肿瘤样本中，高表达趋化因子配体CCL17和CCL22，结合之前关于CCL17和CCL22可以通过CCR4趋向Treg的报道，作者认为肿瘤中LAMP3+ DC可能通过细胞因子通讯作用关系招募Treg细胞（Figure 2F-2H）。
 

4. iCAFs亚群的特征分析

图3 iCAFs和mCAFs的功能分析

作者共鉴定得到两个fibroblasts亚群。基因富集分析结果发现，iCAFs高表达胞外基质重塑、细胞迁移和血管生成等相关基因，暗示可能和肿瘤转移相关。mCAFs组高表达基因主要富集在肌肉收缩和PGC1A通路中，和之前的报道一致（Figure 3A-3F）。

接下来，作者将重点放在和肿瘤转移密切相关的iCAFs上，从四个角度解析了iCAFs的功能特点。
 

4.1 细胞通讯：

利用CellphoneDB2，作者构建了细胞类型间的通讯作用关系。结果发现iCAFs高表达配体CXCL12，其受体CXCR4等在免疫细胞中高表达，暗示iCAFs在调节膀胱癌免疫浸润状态的重要作用。此外，发现iCAFs高表达配体FGF2和FGF7，其受体FGFR3在肿瘤细胞中高表达，暗示iCAFs具有促肿瘤生长的作用（原文Figure 6）。
 

4.2 SCENIC分析：

结果发现iCAFs群显著性高表达TCF21 motif和TWIST2 motif，尽管这两个调控子在其他报道中已经有了较为深入的研究，但是在膀胱癌iCAFs中的作用仍需要进一步探究（Figure 4A-4B）。

图4 iCAFs的SCENIC分析和iCAFs促增殖能力探究
 

4.3 促生长能力验证：

通过细胞通讯分析和GO富集分析，作者发现iCAFs群可能具有促生长能力。为进一步验证该想法，作者体外流式分选出iCAFs并与膀胱癌细胞系共培养，结果发现共培养组展现出更强的增殖能力，证实了膀胱癌iCAFs的促肿瘤增殖作用（Figure 4F-4G）。
 

4.4 公共数据库分析：

使用CIBERSORTx对TCGA数据进行进一步挖掘，结果发现iCAFs和mCAFs丰度和临床预后密切相关。

文章总结

作者发现肿瘤细胞低表达MHC-II类分子，揭示下调肿瘤细胞中免疫原性的功能可能有助于形成一个免疫抑制的微环境。髓系亚群LAMP3+ DC可能通过CCL17和CCL22通讯作用关系招募Treg细胞，参与形成免疫抑制微环境。此外，本文重点探讨了iCAFs的炎性作用，发现iCAFs与临床预后和肿瘤生长增殖等密切相关。以上结果阐明了iCAFs的作用机理，对膀胱癌的治疗提供了新见解。

特别致谢

感谢欧易生物巴永兵和陆瑶在分析中提供的帮助。
 

欧易生物单细胞事业部简介

欧易生物是国内少数具备10x Genomics和BD Rhapsody™单细胞测序双平台的机构之一，在医学和农林方向提供专业的单细胞建库测序及分析服务，包括5’端和3’端基因表达分析、免疫组库分析（TCR/BCR）、 ATAC分析和表面蛋白分析等。

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