在过去的十年中，RNA-Seq技术迅速发展，因为能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，所以广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。由于RNA本身不稳定，而mRNA只占抽提总RNA的3%-4%，且RNA-seq最常用的磁珠富集法对于RNA的完整度要求也很高，所以，提取作为科研实验开始的第一步是十分重要的一个环节。

今天小欧就来为大家带来提取界的葵花宝典，一起来了解RNA提取液氮研磨组织时的注意事项吧~

一、液氮研磨重要性

1、 由于RNA的分子结构特点，RNA极易降解，液氮可以使样本组织瞬间达到低温状态，抑制组织内源性RNase降解RNA；

2、 由于液氮极低的温度可以使样本组织和细胞都变得很脆（对，就是嘎嘣脆的那种~），通过研磨便于细胞的破碎，释放出细胞内部的核酸；

3、组织的匀浆过程是RNA提取是否成功的关键步骤之一，液氮研磨可以保持组织在匀浆过程中持续处于低温状态，防止研磨过程中RNA的降解；

二、液氮研磨的原理(研钵)

液氮的温度为一196℃,它既能使各种组织成分不易被破坏或降解（终止细胞内外一切生物反应，又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎）。

三、液氮研磨流程

1. 灭菌

研钵的灭菌180度烘2h，每份样本使用单独的研钵、镊子、剪刀等取样工具，防止交叉污染，且取样工具需要远离垃圾桶，防止污染样本。

2. 预冷

1) 用记号笔在收集管盖上和管壁上，都写上样品名称；

2) 将样品、收集管、勺子放在液氮中预冷；

3) 将液氮小心加入并浸满研钵，浸泡预冷研杵与研钵（加入液氮时，缓慢加入，防止液氮飞溅），一般加两次液氮就很好的预冷了。

3.放入组织
将组织迅速转移至液氮内，确保组织全部浸没在液氮中。

4.破碎

使用研杵在液氮中轻轻敲打组织，将组织打碎成小块，要注意切勿用力过度，要防止组织块飞溅出研钵；在液氮即将挥发完时，使用研杵对组织样本进行碾压研磨。注意研磨过程要朝着一个方向研磨。

5.中途补充液氮

待液氮挥发完后，立即加入1/3研钵体积的液氮(注意，加入液氮速度要缓慢，切勿使得液氮冲击力过大，将组织样本冲出研钵）。

6. 充分研磨2-3次

迅速用研杵研磨组织，根据组织状态的变化程度，在确保组织始终处于冰冻状态下，及时补充液氮进行研磨，直至组织被研磨成粉末状。

7.收集聚拢样品

最后再补充一次液氮聚拢粉末，用勺子搅拌粉末，待液氮挥发完全粉末泛白。

8.装取样品

用长镊子取出液氮中的样品收集管，用勺子挖取适量粉末样本至收集管中，且要注意，手指不要捏住收集管的管底，要抓住管口的位置，收取后盖好盖子并迅速投入液氮保存；剩余多余样品收集至合适的样品管中，也要迅速投入液氮。

四、注意事项

1.个人防护：佩戴棉手套，注意液氮飞溅冻伤；液氮、裂解液均对人体有危害，注意避免直接皮肤接触，禁止在该实验中穿短裤、凉鞋等会暴露皮肤的服装，必要时可以带上护目镜以保护面部安全；
2.勺子离心管需要预冷；
3.研磨过程中使用的器材均需灭菌；
4.研磨程度越细越好。

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