CUT&Tag技术的简介
众所周知，染色质免疫沉淀（ChIP）是分析转录因子和辅因子与DNA的结合以及组蛋白和组蛋白修饰在整个基因组中的定位的金标准技术。但是该技术步骤繁琐，耗时长，需要的起始样本量很高，而很多研究很难获得足够量的样本开展该实验。随着二代测序技术的发展，ChIP-seq提高了数据的解读通量，但是ChIP技术本身的核心方法自提出至今近30年并没有根本的改进。
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是替换传统的ChIP-Seq来研究蛋白质-DNA互作的新技术。与ChIP相同的是都需要利用抗体识别并结合目标蛋白，不同点在于CUT&Tag技术利用Tn5转座酶与Protein A/G的融合蛋白，把酶引导至与目标染色质结合的抗体。Tn5转座酶预先加上adapter，形成组装的pA/G-Tn5转座体，Tn5可以直接剪切染色质进行文库制备。而所使用的抗体可以特异性靶向特定蛋白，因此所得到的结果可以揭示特定位点或蛋白质结合位置的染色质信息。与ChIP-seq相比，CUT&Tag具有显著优势，如：信噪比高，可重复性好，实验周期短（1天实现从细胞到文库构建），细胞投入量低等，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。
图1 | CUT&Tag实验流程图
CUT&Tag技术的应用
自从2019年CUT&Tag技术出现，迄今为止已经有多篇论文应用该技术进行组蛋白、转录因子功能研究。例如在拟南芥雄配子发育过程中，H3K27甲基化状态的改变可以影响雄配子体中两个细胞系的命运。H3K27me3通常在含有沉默基因的染色质区域富集。研究人员通过CUT&Tag技术发现拟南芥雄配子中的营养细胞有6950个H3K27me3峰，而精子细胞有694个H3K27me3峰，这一结果表明精子细胞中缺少H3K27me3，这一结果与之前的ChIP-Seq研究结果一致。
Runt相关转录因子2（RUNX2）是一种与成骨相关的转录因子，在癌变过程中是一种重要的转录抑制因子。我国学者研究发现，该转录因子与乳腺癌转移密切相关。文章通过CUT&Tag技术发现RUNX2与MTA1共同的结合位点有10455个，且两者具有相同的结合序列。
单链基因组DNA可以折叠成G-四链体（G4）结构或形成DNA:RNA杂交（R环）。最近的研究表明，这种非标准的DNA结构影响基因表达、DNA甲基化、复制叉进展和基因组稳定性。这种结构的功能也可以用CUT&Tag技术进行研究。
从以上研究案例可知，CUT&Tag技术可以识别全基因组中目标蛋白占据的位置的序列信息，这种目标蛋白包含各类组蛋白和转录因子，同时还可以研究染色质本身的特殊结构（G4）。所要求的条件需要有相对应的抗体。
CUT&Tag文库质检要求
CUT&Tag文库的特征与常见的转录组或基因组文库不同，它通常与所研究的蛋白有关，文库峰图通常无统一标准。如图所示。
图2 | 组蛋白H3K27me3的CUT&Tag峰图
图3 | 一种转录因子的CUT&Tag质检图
图4 | 组蛋白H3K4me3的CUT&Tag质检图
CUT&Tag样本要求
1、样本类型：细胞系、组织
2、送样要求：
（1）细胞系：细胞数10-10个左右（细胞数越多结果越好），冻存送样，冻存前细胞活率需>90%，注明样本种属，细胞系种类，无支原体污染；
说明：虽然该方法最低可使用100个左右细胞开展实验，但是如果客户提供细胞数量太少，无法对细胞进行质检，后续的实验效果无法保证，所以建议送样细胞数在10个以上，如果您要研究的是转录因子，细胞数最好达到5×10个以上。
（2）组织样本：
如果需要做单细胞解离，对于动物组织，需要用组织保存液保存样本，并提前与内部实验人员沟通好实验时间，便于及时开展实验。组织量一般在500mg左右。植物组织样本如需制备原生质体，需要寄送活体植物。
如果是制备细胞核开展项目，则无论动物还是植物组织，只需要液氮速冻，干冰寄送就可以了。需提供500mg左右组织。
3、抗体：
CUT&Tag需要一抗和二抗，欧易生物提供二抗。
一抗需要客户提前进行抗体特异性验证（WB条带单一，大小符合预期，无明显杂带，提供的WB图为全图，不要截图，便于实验人员判断抗体的特异性）。
客户需要提供一抗的详细信息：供货商，货号及抗体说明书或链接。
一抗不得稀释，不得反复冻融，可以分装（体积不能少于10μl），建议原管寄送。公司会保存剩余抗体，实验完成后可返还抗体。
寄送时要注意抗体的保存温度。客户需填写清楚靶蛋白的信息。
CUT&Tag项目的相关问题
1.CUT&Tag适用于什么物种?
CUT&Tag 技术广泛适用于常规哺乳动物细胞的蛋白质-DNA互作研究，酵母、植物等细胞可以经过特殊的处理(破除细胞壁或者提取细胞核)来进行实验。
2.需要做IgG的阴性对照吗？
在CUT&Tag实验中包括IgG对照的目的是确定pA-Tn5是否特异性的定位于抗体所在/富集的基因组区域。与ChIP-Seq中使用的input对照不同，此阴性对照不用于分析。添加IgG对照不会增加任何有价值的信息，因为pA-Tn5已经被证明是特异的。但是，如果需要添加IgG作为对照，也是可以的。
3.CUT&Tag是否需要像ChIP-Seq一样的Input对照？
不需要。
4. 是否可以返还CUT&Tag实验回收的样本用于qPCR检测？
CUT&Tag实验回收的样本不能用于qPCR检测。
5.CUT&Tag是否可以用于标签蛋白？
可以。
6.CUT&Tag文库的质控标准是什么？
CUT&Tag文库生成后，应通过TapeStation 或 Bioanalyzer来评估文库的质量，Qubit测定文库的浓度，文库的常见图谱可见图2和图3。
7.细菌样本是否可以做CUT&Tag实验？
Con A beads通过结合糖蛋白与细胞膜结合，细菌有一层细胞壁，不能直接与Con A beads结合。且细菌没有完整的核结构，因此无法开展此项实验。
附录：细胞系冻存（只针对细胞系悬液）：
1. 从培养箱中取出细胞，显微镜下观察，确定生长状态良好且无污染；
2. 取合适时期的细胞培养液，每管分装细胞数量10~10个， 各准备 2 管（生物学重复样本另算），300 g 离心 5 min，吸弃培养液，用 1 mL 室温 1 x PBS清洗细胞 2~3 次，离心后吸弃上清 PBS；
3. 加入 1mL预冷的细胞冻存液，轻轻吹打细胞沉淀混匀， 慢速降温冻存。梯度降温：4℃ 10 min→ -20℃ 30 min→ -80℃ 16～18 h（过夜）→液氮；或者程序降温：使用等速降温机以-1～-3℃/min 由室温降至-80℃~-120℃，→液氮。
注：
1、冻存细胞是90%培养基+10%DMSO中放置在-80℃里保存的。不要用液氮快速冷冻你的样品，因为会使你的细胞裂解、染色质外漏，会导致你的背景信号非常高。在进行CUT&Tag步骤之前，37℃快速解冻细胞。
2、对于贴壁细胞来说，关键是不要用胰蛋白酶分离细胞，因为它会破坏细胞与刀豆球蛋白A结合的表位。使用无酶分离法收集细胞，如使用细胞刮刀。
参考文献
[1] Xiaorong Huang, Meng-Xiang Sun, H3K27 methylation regulates the fate of two cell lineages in male gametophytes, The Plant Cell, 2022;, koac136, https://doi.org/10.1093/plcell/koac136
[2] Yin X, Teng X, Ma T, Yang T, Zhang J, Huo M, Liu W, Yang Y, Yuan B, Yu H, Huang W, Wang Y. RUNX2 recruits the NuRD(MTA1)/CRL4B complex to promote breast cancer progression and bone metastasis. Cell Death Differ. 2022 May 9. doi: 10.1038/s41418-022-01010-2. Epub ahead of print. PMID: 35534547.
[3] Lyu J, Shao R, Kwong Yung PY, Elsässer SJ. Genome-wide mapping of G-quadruplex structures with CUT&Tag. Nucleic Acids Res. 2022 Feb 22;50(3):e13. doi: 10.1093/nar/gkab1073. PMID: 34792172; PMCID: PMC8860588.
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