1. Visium HD的技术特色是什么？

Visium HD最大的技术特色就是其创新性的玻片设计。Visium HD玻片有2个捕获区域，每个捕获区域为6.5*6.5 mm，捕获区域周围有基准框架用于图像对准。无间隙全覆盖的寡核苷酸捕获区由2*2µm的条形码方块（barcoded squares）组成。根据10x官方建议，生信分析时可选用8*8µm的bin，分辨率可达到单细胞水平。

捕获区域的寡核苷酸序列包括：Illumina TruSeq Read1 T测序引物、唯一分子标签（UMI）和空间条形码（spatial barcode）以及30 nt的ploy（dT）序列。

Visium HD玻片捕获区（上）及序列结构（下）示意图【图片来源：10xGenomics】

2. Visium HD 实验的关键技术原理是什么？

Visium HD与Visium CytAssist（V2）的实验技术原理相同，主要涉及两个关键技术：

（1）根据人和小鼠的已知基因序列设计的靶向探针对。

每个探针对由左臂（LHS）和右臂（RHS）组成，LHS探针包含部分Read 2S以及与mRNA靶向位点互补的左侧25bp序列。RHS探针包含与目标mRNA位点互补的右侧25bp序列和一个30bp的poly（A）。

探针结构示意图【图片来源：10xGenomics】

（2）基于CytAssist的原位转片技术。

在CytAssist转片仪上，探针杂交的组织玻片与10x Visium HD玻片紧密对接，形成几无缝隙的捕获区密闭区域，组织中的RNA被反应体系中的RNase消化，释放出的探针通过poly（A）被Visium玻片上的poly（dT）序列捕获。

CytAssist转片原理【图片来源：10xGenomics】

3. Visium HD的样本如何准备？

Visium HD目前仅适用于人和小鼠的FFPE样本，样本准备要求与Visium CytAssist（V2）相同。为获得理想的测序数据结果，应确保组织样本的细胞核形态正常、有高质量的RNA以及在实验过程中不会出现脱片等异常情况。为此，准备样本时需注意以下几点：

（1）尽量提供石蜡块。

（2）若只能提供石蜡切片，需满足：

      ① 切片厚度5µm，切片需要干燥处理；

     ② 正式实验的组织需使用10x推荐的品牌玻片，并且贴片位置应符合相应玻片型号的贴片要求；

10x官方推荐的玻片品牌型号及贴片区域（绿色框内）【图片来源：10x Genomics】

     ③ 一些特殊样本（如皮肤、血管、脂肪、肌腱、乳腺、肺、结肠、多核组织或者富含大量结缔组织的样本），强烈建议使用防脱玻片进行贴片（10x推荐的防脱玻片为Schott H-3D载玻片，PN-1800434），以减少后续实验中的脱片风险。

（3）运输条件：4℃运输（石蜡切片应保持干燥条件，具体参见欧易送样指南）。

（4）RNA抽提质检要求DV200＞30% ，峰型正常。

4. Visium HD 的实验流程是怎样的？

Visium HD的实验流程与Visium CytAssist（V2）相同，包括以下主要实验步骤：

（1）样本准备与成像：将FFPE样本切片贴于载玻片（10x推荐品牌）有效转片区域内，进行脱蜡、HE染色与图像扫描、脱色和解交联，然后立即进行探针杂交。

（2）探针过夜杂交并清洗后，进行探针连接。

（3）在CytAssist转片仪上完成转片。

（4）将Visium HD玻片置于PCR仪上进行探针延伸。

（5）洗脱并收回探针进行预扩增与文库构建。

（6）高通量测序与数据分析。

5. Visium HD的文库结构是怎样的？

Visium HD探针文库结构如下图所示。Read 1T和Read 2S用于区分双端测序的引物位点。测序数据中，Read 1用于区分空间条形码（Spatial Barcode）和UMI序列（共43 bp），Read2用于区分插入的探针序列（50bp）。测序模式为PE150，测序深度为每个样本框275 million reads。

6. Visium HD是否可以拼片？

由于Visium HD只适用于FFPE样本，而FFPE样本贴片时需要在水中进行展片和捞片。对于需要拼片的样本，需要玻片多次入水捞片，可能会造成先贴片的组织出现脱片的风险，尤其是当样本类型为易脱片组织时，在后续实验中出现脱片的风险非常高。因此，对于需要拼片的样本，一般要求同一个样本框中拼片不超过2个。

7. Visium HD的探针与Visium CytAssist（V2）是否相同？

对于人的探针，在Visium CytAssist（V2）中已经进行了版本升级，每个基因设计有3对探针，Visium HD采用了相同的探针版本。但对于小鼠的探针，在Visium CytAssist（V2）中采用的是每个基因仅1对探针的V1版本，而Visium HD中则升级为每个基因有3对探针的V2版本。因此，Visium HD平台对于小鼠样本而言，除了分辨率提升至单细胞水平外，在基因的检出效率上（基因中位值）也会有一定提升。

8. 如何获得Visium HD探针所对应的基因列表？

有以下两种方式可以获取：

（1）直接联系欧易当地销售经理咨询，由欧易公司内部提供；

（2）到10x Genomics 官方网站搜索，可以看到以下两个文件，根据需要自行下载即可。

9. Visium HD已测试的样本类型有哪些？

我们整理了10x 官网公布的已做过测试的样本类型（见下面表格）。因为Visium HD也是基于CytAssist的实验流程，所以，对于我们项目经验中已经在Visium CytAssist上成功的FFPE样本，一般都可以适用于Visium HD。同样地，在Visium CytAssist上做失败的样本，也很难在Visium HD上成功开展实验。如有需求，可以联系欧易当地销售经理进行咨询。