10x Genomics FLEX单细胞转录组测序

单细胞水平对转录组进行测序可以研究单个细胞内的基因表达情况，同时解决用组织样本测序无法解决的细胞异质性难题，让解析单个细胞的行为、机制及其与机体的关系成为了现实。10 X Genomics单细胞转录组测序平台利用微流控、油滴包裹和Barcode标记等技术来实现高通量的细胞捕获技术，能够一次性分离、并标记500–10000个单细胞，从而获得每个细胞的3’端的转录组信息。具有细胞通量高、建库成本低、捕获周期短等优势，但存在仅限于新鲜样本务必及时处理，可能导致样本批次差异的问题。

10x Genomics Single Cell Gene Expression FLEX单细胞转录组测序技术（以下简称FLEX），采用4%的多聚甲醛（PFA）对细胞进行固定，一步锁定RNA表达状态， 解决了样本储存、多样本批次处理的问题，同时解锁FFPE样本的单细胞转录组测序功能。该技术不仅可用于样本固定，更配备有实惠的混样测序整体解决方案。

技术优势

• 操作步骤更加简单易行

仅需多聚甲醛固定，操作简单，改进样本采集、制备和处理流程

• 样本采集更加灵活

固定样本生物学状态，便于样本存储运输，将样本采集扩展到多个采集点的样本，缓解单细胞样本采集的限制

• 打破脆弱样本、珍贵样本的限制

锁定脆弱细胞或快速变化细胞生物学状态，将实验范围扩展到脆弱或濒死细胞、状态可能不断变化以及珍贵细胞

• 优于或与常规单细胞转录组相当的分析结果

数据表现优良，关键有效数据量、基因表达量、分群结果与常规单细胞表现一致，且可提高低表达基因的检出率

• 百万级细胞的高通量，混样降低实验成本

单通道中最多可混16个样品，单张芯片最多可混128个样本，最多可得1,024,000个细胞，混样降低实验成本

• 减少生产试验的批次效应

样本固定后集中处理，在同一次运行中批量操作实验和分析，最大限度减少实验可变性

样本要求

分析结果展示（部分）

降维聚类结果图

图片说明：横纵坐标分别代表降维的第一和第二主成分，图中的每个点代表一个细胞，不同群的细胞以不同颜色区分

细胞群间相关性热图

图片说明：横纵坐标为不同细胞群，图中的数字为皮尔森相关性系数

该值越大，热图颜色越红，表示细胞群之间的相关性程度越高

 GO 富集分析结果展示

图片说明：图中横轴为 GO 条目名称，纵轴为 -log10pValue

常见问题

Q1. 考虑拼单的可能性，同一物种同一样本类型可以混合上样吗？

答：FFPE样本不同组织类型可以考虑拼单，其他样本不同组织类型不建议拼单。

这是由于新鲜样本，不同组织类型基因数差异大，文库丰富度不同，同样测序饱和度，数据产出不均匀，而FFPE样本基因表达丰度均比较低，可以考虑拼单，但不要不同客户之间拼单，拼单有风险，个别样本质量问题会导致所有样本结果失败。

Q2 多样本混合是否存在个体捕获差异？

答：计数正常，样本类型接近，复杂度相似的情况，没有大的捕获差异。

风险提示：由于细胞核计数不准，会导致细胞捕获数差异较大的情况。

Q3. 石蜡样本做FLEX，对组织石蜡块质量有什么要求？

答：目前，10x官方也还没有一种确定能够在FLEX实验中准确、可重复地预测石蜡样本质量的质控方法。根据已有项目经验，发现在Visium CytAssist 空间基因表达分析中表现良好的FFPE样本在FLEX中表现也比较好。对于未经测试的FFPE样本，强烈推荐先进行小样本量的预实验，再开展大样本量实验。

Q4. 与常规单细胞或单细胞核测序相比，FLEX有哪些优劣势？

答：优势：①通过固定可以及时锁定细胞状态，反应更真实的基因表达信息，数据质量也更稳定；②可以实现不同批次或不同时间点处理的样本分别收集固定后一次上机和建库，减少批次效应；③可以实现多样本混合上机，尤其是样本量大的情况下，可以显著降低成本；④为FFPE样本的数据信息挖掘提供了可能，尤其与CytAssist FFPE空间转录组相结合，极大开拓了FFPE样本的利用空间。

劣势：①物种限制：由于采用探针杂交方式捕获RNA，因此严格受物种限制，目前仅可用于人和小鼠。②检测基因限制：只有探针覆盖的基因能够被检测到，无法检测出探针未覆盖的基因、新基因或新转录组本。

Q5.FLEX的石蜡样本的结果可以和新鲜样本的单细胞转录组一起分析吗？

答：可以分析，但是技术上不推荐，因为 FLEX 检测石蜡样本是通过探针捕获的方式，reads 覆盖的深度会高很多。如需一起分析建议石蜡样本和 新鲜样本都分别用 FLEX 方法测序。