在生命科学研究的探索当中，细胞作为生物体构成的基础单位，体积虽小却也蕴含着无限的奥秘。10X Genomics作为单细胞与空间领域的开拓者，不断革新技术，为广大基础和临床研究者提供了先进的端到端的产品。Xenium原位分析是10x Genomics推出的不同于基于原位捕获来进行空间检测的单细胞空间技术，通过挂锁式探针滚环扩增和荧光成像的方式，实现灵敏且特异的精准检测。本文将对Xenium技术的各项特点进行展示说明，让大家能够更加深入的了解Xenium的运用场景（注：本文所有图片和数据均来自于10X Genomics官方资料）。
图1 10X Genomics Xenium in Situ技术总结
1、Xenium技术原理
Xenium采用挂锁式探针，探针由两端基因特异性序列结构和中部荧光探针特异性杂交位点构成。探针与组织样本原位 RNA 杂交过程中，仅当两端特异性序列精确匹配形成挂锁结构，方可连接成环进行滚环扩增，形成带有高密度荧光探针特异性序列团。再通过多轮荧光探针杂交成像，形成原位荧光信号序列，解码荧光序列即可获得该位置所属基因。不同基因探针浓度会根据表达量微调，使靶基因检测具有较好的灵敏度和特异性。
图2 挂锁式探针杂交扩增流程
2、Xenium实验流程
1. 样本制备：将FF或FFPE组织切片放置在Xenium载玻片上，FF切片进行固定和透化，FFPE切片进行脱蜡和解交联。
2. 探针杂交、连接、滚环扩增：双端特异性识别目标基因并与其杂交，对形成锁环的原始探针序列进行滚环扩增，最后形成高密度带有荧光探针特异性结合序列的扩增产物。
3. 染色：进行细胞分割染色、自身荧光淬灭、DAPI染色。
4. 上机：荧光探针杂交、成像、解码。
图3 Xenium实验流程
3、Xenium技术优势
1. 更大视野以及更高分辨率
Xenium不同于10X推出的Visium系列产品，Visium V2和HD是利用探针原位捕获组织中的转录信息，再通过CytAssist仪器来进行转片，如此，与RNA杂交的探针便能够被玻片上带有空间位置信息的寡核苷酸捕获，再通过测序和比对，则会有每一个基因的空间位置信息。Xenium是通过荧光探针杂交，每个基因生成一个荧光特征条码来实现基因的定位和识别，通过此种方法，Xenium的分辨率便可达到单细胞级别甚至是亚细胞级别。此外，在10X同等分辨率的对比下，Xenium的捕获面积要远高于Visium HD 的捕获面积，能够容纳更大的样本面积。
图4 Visium HD玻片和Xenium玻片对比
2. 稳定而灵敏的检测表现
根据官方数据，以Xenium 5000为例，它在不同组织类型中表现是高度可复现的。通过对组织的临近切片进行同样的实验，最后对每个细胞中的转录本数量进行作图，结果的高度相关性证明了Xenium5000的实验稳定性。
图5 Xenium 5000基因 panel在不同物种和组织中的表现稳定且可重复，临近切片的单基因检测灵敏度的相关系数最高可达0.98
Xenium因为其挂锁式探针的设计和滚轮扩增，大大的增加了其检测的灵敏度，并且能够对同源异构体和SNP进行检测。通过对不同FFPE样本的检测，10X官方也对Xenium和Visium HD的性能做出了比较，简单来说，Xenium的单基因灵敏度为Visium HD的3.18倍，但这个数值也会受到测序深度的影响。总的转录本丰度，则是HD更胜一筹，大概是Xenium数据的1.54倍。这也体现了两种技术各有优势，Xenium在单基因检测灵敏度上比Visium HD更好，而Visium HD因为其技术原理，能够检测出更多的基因并且在转录本丰度上面有着更好的表现。
3.基因panel的多重选择，灵活科研
10X Genomics 为广大科研者提供多种可组合的Xenium panel方案。基础panel数量已从数百基因被升级至5000个基因，满足筛选功能。也可以在5000个基因的基础上，自行设计100个靶基因，实现对特殊基因的检测分析。10X Genomics也可帮助研究者定制基因panel，最多可达480个基因，且物种上几乎无限制。
4.多模态细胞分割
准确的细胞边界分割对于细胞类型确认有着直接作用。Xenium新推出了多模态细胞分割方法，通过结合多种特殊染料，并对染色结果进行优先级别排序，再结合机器学习方法，能够实现精准客观的细胞边界鉴定。
图6 多模态细胞分割检测方案
不同于之前利用细胞核染色来辨别细胞形态，因为细胞形状并非均一的圆形，单纯依赖于将细胞核作为起点，向周围进行扩张的方法无法有效客观的分割形态特殊的细胞，如成纤维细胞。
图7 多模态细胞分割能够精准划分细胞形态
5.多元数据整合
实现同一张切片上的不同检测目的，Xenium的非破坏性实验分析流程能够在运行后保持组织形态完整性，即在同一张新鲜冷冻或FFPE切片上获得RNA、IF和形态学信息，与组织病理学研究无缝整合。
图8 非破坏性实验流程能够允许研究者在Xenium实验后利用同一张切片进行其他检测
6.完善的下游配套分析软件
和10X Genomics的其他产品一样，10X Genomics也为Xenium开发了直观便捷的数据可视化软件和分析流程，且可与第三方分析工具兼容。Xenium分析仪中自嵌有软件分析流程（Xenium Onboard Analysis或XOA），数据采集和处理同步进行，在运行结束后会立即生成可解读、可观测的数据。运用10X Genomics开发的Xenium Explorer，通过软件内置的各项功能，能够帮助使用者对组织形态、细胞分割、细胞分型和转录本密度进行分析。
图9 利用Xenium Explorer可视化基于5000+100基因panel 检测的人乳腺癌FFPE样本
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总的来说，相比起传统的原位杂交技术，Xenium能够快速的在单细胞和亚细胞水平大量的分析候选基因。对于组织中细胞形状不规则和大小不一的情况，Xenium的多模态细胞分割方法能够提供较为客观的结果，对比起Visium V1、V2和HD，Xenium在此场景下的应用更为合适。Xenium也可以和单细胞以及其他空转平台数据进行联合，通过对全转录组的检测，筛选出候选生物标志物，再利用Xenium对这些候选标志物进行更加深度的分析，也是目前比较标准的Xenium分析思路。