WRKY转录因子作为植物免疫调控网络的核心组分，通过识别病原相关分子模式（PAMPs）和调控防御相关基因表达，在植物抗病反应中发挥关键作用。然而，WRKY成员如何参与甘蔗对黑穗病的抗性调控尚不明确。
近日，中国热科院生物所研究团队在Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“ScWRKY2: a key regulator for smut resistance in sugarcane”的研究论文，通过转录组数据分析鉴定到了1个甘蔗黑穗病抗性的负调控关键基因ScWRKY2，通过Dap-seq、酵母双杂交筛选等发现ScWRKY2抑制免疫相关基因表达，并能够结合叶绿体蛋白诱导ROS清除相关基因表达，对甘蔗抗黑粉病的抗性产生负调控作用。
文库与诱饵
酵母文库：被S. scitamineum感染的甘蔗文库
诱饵蛋白：ScWRKY2
筛选方法：酵母双杂交（GAL4系统）
验证方法：Y2H assay/BiFC/CoIP/Pull-down
1. ScWRKY2的鉴定与表征
WRKY转录因子已被广泛报道在植物响应病原胁迫中发挥调控作用（Meng et al., 2024; Wang et al., 2022）。课题组先前对黑穗病抗性和敏感性甘蔗进行了转录组测序，发现18个WRKY家族转录因子与黑穗病有关。其中ScWRKY2在抗黑穗病品种中下调表达，在感病品种中上调表达（图1a），提示其可能作为负调控因子参与抗病响应。ScWRKY2含有典型WRKY结构域，属于第IIa亚家族，与水稻OsWRKY76同源性较高。启动子分析发现其含胁迫响应元件，且表达受SA和MeJA强烈诱导。亚细胞定位显示ScWRKY2为核蛋白，无自激活活性，适合用于互作蛋白筛选。
图1. ScWRKY2基因的鉴定与基本表征
2. ScWRKY2过表达负向调控小麦黑穗病抗性
为探究ScWRKY2基因的抗病功能，研究者首先在本氏烟草中稳定过表达该基因。通过除草剂筛选获得T3代纯合株系（OE1和OE2），其ScWRKY2转录水平显著高于野生型（WT）。接种烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）2天后，OE1和OE2叶片出现明显水渍状病斑，且DAB染色显示更深的褐色（H₂O₂积累增加），病斑面积分别为WT的2.31倍和1.58倍，表明ScWRKY2负调控转基因植物的抗病性。
进一步通过农杆菌介导法将过表达载体pCAMBIA3300-ScWRKY2（图2a）转化甘蔗品种ROC22（图2b-e），经蛋白、DNA及转录水平检测获得15株过表达株系（图2f-h）。筛选高表达株系（#OE1-#OE3）接种黑穗病菌后，转基因株系株高显著低于WT（图2i），发病率达WT的3.83-4.67倍（图2j）。病原菌定量显示接种后2天和5天时转基因株系中病菌含量显著更高（图2k），且SOD和POD酶活性显著低于WT（图2l,m），证实ScWRKY2负调控甘蔗对黑穗病的抗性。
图2. ScWRKY2 负向调控甘蔗对黑穗病抗性的功能验证
3. 黑穗病感染甘蔗过程中ScWRKY2相关基因调控网络分析
为解析ScWRKY2在抗黑穗病中的调控网络，研究选取野生型（WT）和转基因株系#OE3在接种黑穗病菌0天和5天后的甘蔗芽进行转录组测序和WGCNA分析。差异基因分析显示ScWRKY2过表达主要引起基因下调效应。关键模块基因显著富集于MAPK信号、植物激素和植物-病原互作通路，其中LRR受体激酶FLS2在野生型中上调而在转基因株系下调，提示ScWRKY2可能通过抑制FLS2介导的免疫信号通路负调控抗病性（图3）。这些发现为阐明ScWRKY2的免疫抑制机制提供了多组学证据。
图3. 感染黑穗病甘蔗的差异基因分析
4. ScWRKY2可以直接调控甘蔗中ScLRR-RLK的表达
为鉴定ScWRKY2调控的全基因组下游靶基因，本研究通过DAP-seq联合RNA-seq解析了ScWRKY2的转录调控网络，发现其优先结合含W-box（TTGAC[T/C]）的启动子区，并调控植物-病原互作及光合作用相关基因。关键靶基因ScLRR-RLK（一种LRR受体激酶）的启动子被ScWRKY2直接结合并抑制表达，而ScLRR-RLK过表达可增强植物抗病性和ROS清除能力（图4）。这些结果揭示了ScWRKY2通过抑制免疫受体基因ScLRR-RLK的表达负调控甘蔗抗黑穗病的分子机制，为抗病育种提供了新靶点。
图4. ScWRKY2直接调控的基因鉴定
5. ScWRKY2与ScPsbP相互作用以维持ROS稳态
为鉴定ScWRKY2的互作蛋白，研究以ScWRKY2为诱饵，通过酵母双杂交（Y2H）筛选黑穗病菌侵染的甘蔗cDNA文库，共获得88个阳性克隆，包括叶绿体蛋白ScPsbP。并通过HDOCK分子对接预测、Y2H和双分子荧光互补（BiFC）、CoIP等多方法验证了二者在核内形成复合体（图5e,f）。ScPsbP作为光合系统II组分，之前被报道过通过调控叶绿体ROS等防御信号参与植物抗病，本次研究发现其与核定位转录因子ScWRKY2的跨界互作具有特殊生物学意义。共表达实验表明该互作导致H₂O₂积累增加、ROS清除能力下降，从而增强植物感病性。这揭示了ScWRKY2除抑制ScLRR-RLK转录外，还通过"劫持"叶绿体防御信号组分ScPsbP来干扰ROS稳态的双重免疫抑制机制，为理解植物抗病调控网络提供了新视角。
图5.ScWRKY2 与 ScPsbP 相互作用
ScWRKY2负调控甘蔗抵抗黑穗病的工作模型
本研究发现病菌侵染时，ScWRKY2蛋白能够结合免疫相关基因ScLRR-RLK启动子区域的W-box元件，从而抑制其表达。与此同时，ScWRKY2与叶绿体蛋白ScPsbP相互作用，诱导ROS清除相关基因上调，进而抑制活性氧（ROS）生成。基于上述机制，ScWRKY2负向调控甘蔗对黑穗病的抗性。本研究为甘蔗抗病育种提供了理论依据和基因资源。
本项目中所用的感染黑穗病甘蔗酵母cDNA文库由欧易生物构建。
中国热科院生物所王东姣助理研究员为该论文的第一作者。中国热科院甘蔗研究中心主任/热带作物生物育种全国重点实验室/中国热科院生物所/三亚研究院阙友雄研究员、吴期滨副研究员和福建农林大学/农业农村部甘蔗生物学与遗传育种重点实验室苏亚春副研究员为共同通讯作者。本研究得到了中国热带农业科学院国家热带农业科学中心科技创新团队、广西科技重大专项、热带作物生物育种全国重点实验室科研项目、中央引导地方科技发展专项、国家重点研发计划、国家自然科学基金以及中央级公益性科研院所基本科研业务费等项目的联合资助。
原文链接：https://doi.org/10.1111/pbi.70186