研究概况
酸甜可口的猕猴桃太好吃了，但有时候买回家的猕猴桃还硬梆梆的，等不及咬一口，感觉满嘴的湿淀粉口感，还很酸，怎么破？如何不经过化学催熟，也能吃到好吃的猕猴桃呢？让我们来看看猕猴桃专家的新发现吧。
近日，华中农业大学曾云流研究团队于Plant Communications发表的题为“A cool temperature-induced ubiquitination-controlled transcription factor promotes starch degradation and ripening in kiwifruit”研究论文，发现了猕猴桃在低温（5-10 ℃）条件下，不依赖于乙烯信号通路即可启动淀粉降解和果实成熟的分子机制，为温度对果实采后品质的调控提供了理论基础。
本项目中的猕猴桃外果肉酵母文库由欧易生物构建。
研究背景
猕猴桃成熟高度依赖乙烯，但外源乙烯易导致过快软化、货架期缩短，生产中常用1-MCP抑制乙烯感知，却常造成淀粉转化不足、风味欠佳。有趣的是，部分猕猴桃品种在5°C低温储存时反而比常温（20°C）表现出更快的淀粉降解和糖分积累，且该过程不依赖乙烯，但其分子机制尚不清楚。本研究旨在揭示乙烯信号被阻断条件下，凉爽温度（5–10°C）如何独立诱导淀粉降解，并鉴定关键转录因子及其上游调控模块。
文库与诱饵
酵母文库：“金塘三号”猕猴桃外果肉cDNA文库
诱饵启动子：AcCTS1
筛选方法：酵母双杂交
验证方法：Y2H assay/Co-IP/Dual-LUC等
研究思路
核心发现
1. 低温可促进猕猴桃成熟
为探究非胁迫温度对猕猴桃成熟的影响，研究者将三个品种经1-MCP处理（阻断乙烯感知）后分别储存在1°C、5°C、10°C、15°C和20°C，检测各温度下猕猴桃成熟度参数变化，结果显示：
在1-MCP处理且无乙烯产生的果实中，5°C和10°C储存30天后，果实硬度下降、淀粉含量减少、SSC（可溶性固形物含量）升高，变化幅度显著大于1°C和20°C（图1A）；
3个品种的淀粉含量与硬度变化呈高度正相关（图1B）；
代谢组分析显示：CTRK（凉爽温度成熟）与ERK（乙烯诱导成熟）的代谢谱聚类分离；CTRK特异性富集脂质代谢物，ERK富集酚酸代谢物（图1C）。
综上表明，5–10°C低温可在无乙烯条件下独立促进猕猴桃成熟与淀粉降解。
图1.经1-MCP处理的猕猴桃在不同温度储存期间的生理及代谢物变化
2. β-淀粉酶AcBAM3.3参与低温诱导的淀粉降解过程
通过转录组比较CTRK（低温处理）与ERK（乙烯处理）样本，九象限关联分析鉴定出133个在两种猕猴桃品种中均被低温诱导上调的基因（图2A-C）。其中，AcBAM3.3仅在CT组上调，而AcBAM3.1、AcBAM3.2和AcBAM3.5在CT和乙烯处理均上调（图2D）。酶活性测定显示，BAM酶活在CT处理下持续升高，22天时增加1.4倍（图2E）。在番茄果实中过表达AcBAM3.3或AcBAM3.5使淀粉含量降至野生型的25%–52%（图2F），在猕猴桃愈伤组织中也观察到类似现象。因此，研究者认为AcBAM3.3是CT特异性响应的关键β-淀粉酶基因。
图2.低温与乙烯处理下猕猴桃成熟过程中淀粉代谢相关的转录组数据及基因表达
3. AcCTS1 是低温诱导特异性的转录激活因子
从133个低温特异性上调基因中筛选出15个转录因子，其中AcCTS1（ERF家族）上调幅度最大（9.4倍）。双荧光素酶实验显示，AcCTS1可使AcBAM3.3和AcBAM3.5启动子活性分别提高3.0倍和2.0倍。酵母单杂交及EMSA证实，AcCTS1直接结合两启动子中的保守DRE基序（GCCGAC），突变后结合消失。LUC活体成像进一步验证其激活作用。综上，AcCTS1是直接激活AcBAM3.3/3.5转录的低温特异性因子（图3）。
图3.AcCTS1可激活AcBAM3.3和AcBAM3.5的表达
4. AcCTS1可增强低温诱导的猕猴桃淀粉降解作用
为验证AcCTS1功能，在猕猴桃愈伤组织中过表达AcCTS1，发现AcBAM3.3和AcBAM3.5表达分别升高7.2倍和2.1倍，淀粉含量降低46%。利用CRISPR-Cas9获得两个cts1突变系，其AcCTS1蛋白几乎不表达。在CT处理下，野生型愈伤组织中AcBAM3.3/3.5上调、淀粉含量下降25%，而突变系中该响应被完全阻断（图4）。在猕猴桃果实中瞬时沉默AcCTS1（RNAi）导致AcCTS1蛋白减少，AcBAM3.3/3.5表达下降，淀粉含量升高，BAM酶活和总糖含量降低（图4）；相反，过表达AcCTS1促进淀粉降解。综上，AcCTS1是CT诱导淀粉降解的核心正调控因子。
图4.AcCTS1调控猕猴桃中低温诱导的淀粉降解
5. AcPUB11 作为E3泛素连接酶靶向降解AcCTS1
为鉴定AcCTS1在响应低温刺激时的调控因子，研究者通过酵母双杂交筛选经低温诱导的JT猕猴桃外果肉文库，鉴定到一个E3泛素连接酶AcPUB11（AtPUB11同源），其与AcCTS1在酵母中相互作用（图5A）。LCI、BiFC、GST pull-down等实验进一步证实了体内外的直接互作（图5B–5E）。在CT处理下，AcPUB11蛋白水平下降，而AcCTS1蛋白积累，但AcPUB11转录水平反而升高，提示调控发生在蛋白水平。体外泛素化实验显示，AcPUB11直接催化AcCTS1多聚泛素化（图5F）；体内泛素化实验也证实共表达AcPUB11增强AcCTS1的泛素化（图5G）。加入26S蛋白酶体抑制剂MG132可阻断AcPUB11介导的AcCTS1降解（图5H）。综上显示，AcPUB11通过泛素-蛋白酶体途径负调控AcCTS1的稳定性。
图5.AcPUB11与AcCTS1互作并对其进行泛素化修饰，从而促进其通过蛋白酶体途径
6. AcPUB11 负调控AcCTS1介导的淀粉降解
双荧光素酶报告实验表明，AcPUB11显著抑制AcCTS1对AcBAM3.3和AcBAM3.5启动子的转录激活作用，而MG132可部分恢复该激活。在猕猴桃愈伤组织中敲除AcPUB11，AcCTS1蛋白积累，AcBAM3.3/3.5表达升高，淀粉含量下降约20%。在猕猴桃果实中瞬时过表达AcPUB11导致AcCTS1蛋白减少，AcBAM3.3/3.5表达受抑，淀粉含量升高，BAM酶活和总糖含量降低；而沉默AcPUB11则促进淀粉降解。这些结果证明，AcPUB11通过降解AcCTS1，负调控低温诱导的淀粉降解过程。
研究总结
图6. 猕猴桃低温诱导淀粉降解的调控网络示意图
本研究首次系统揭示了低温（5–10°C）通过E3泛素连接酶AcPUB11对转录因子AcCTS1的稳定性调控，进而激活淀粉酶基因AcBAM3.3/3.5，启动淀粉水解，驱动猕猴桃乙烯非依赖性成熟。这一发现不仅更新了温度调控果实成熟的工作机制，也为采后精准控熟技术提供了新的理论基础。
原文链接
https://www.cell.com/plant-communications/fulltext/S2590-3462(26)00044-1
华中农业大学果蔬园艺作物种质创新与利用国家重点实验室李昂为论文第一作者，曾云流副教授为通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国博士后科学基金等的支持。