在评估组学数据质量后，作者采用PCoA和PLS-DA分析发现，与正常组相比，合并上消化道病变的受试者表现出可区分的微生物和代谢特征（图 1B-D）。随后采用PERMANOVA来量化这些因素对微生物群和代谢物组成的贡献（图 1E），并发现有若干个因素显著影响组学数据变异，如样本收集中心的区别等，并于后续分析中据此进行矫正。此外，进展过程中不同阶段更能显著贡献于唾液微生物群和代谢物个体差异，这一关键差异凸显了唾液样本在上消化道疾病进展分层中的潜在应用价值。同时，作者进一步量化了上消化道病变受试者中病变起源的贡献。仅病例的PERMANOVA分析显示，解剖学起源和组织学起源仅解释了组学变异的一小部分。这些结果表明，病变起源对整体组学变异的贡献较为有限。随后，作者刻画了病例组和正常组之间的微生物和代谢改变。共有85种唾液物种、126种唾液代谢物和22种血浆代谢物表现出显著差异丰度，病例组中124种唾液代谢物和19种血浆代谢物显著耗竭，而仅有2种唾液代谢物和3种血浆代谢物显著富集（图 1G、H）。这些发现提示一种潜在的机制联系，即微生物扩张可能与特定宿主代谢物的消耗相关。

为刻画与上消化道癌症及癌前病变相关的唾液微生物群，作者进行了宏基因组学的多组比较分析（图 2A）。发现Pseudomonadota（假单胞菌门）、Bacteroidota（拟杆菌门）和Bacillota（厚壁菌门）构成四组中三个优势分类群。最显著的变化出现在LGIN和正常组之间。相反，UGIC与正常组之间未检测到统计学显著差异。病变组与正常组之间的Shannon指数无显著差异，而Simpson指数在LGIN和HGIN组中显著低于正常对照组（图 2D、E）。进一步分析发现，多种耐氧或兼性厌氧分类群，在癌前病变（尤其是LGIN阶段）中相对丰度更高。此外，与以往晚期肿瘤研究不同之处在于，作者发现多种典型口腔厌氧菌，包括Prevotella等，在病变组中相比正常组显著下调（图 2G）。这些结果说明，LGIN阶段是唾液微生物群生态演替的关键转折点。在这一癌前阶段观察到的多样性显著丧失和独特的结构重排，提示唾液菌群失调是一个早期发生的事件，可能与从正常黏膜到低级病变的初始转变相关。通过解剖部位的分析，作者发现所观察到的唾液微生物特征并非仅归因于食管或胃起源，而是反映了跨上消化道病变的共享微生物改变。

图2 在整个UGIC病程中，唾液微生物群落的多样性与组成均发生改变

鉴于唾液微生物群与宿主-微生物共代谢之间的复杂相互作用，作者对唾液和血浆进行了非靶向代谢组学分析，以刻画与上消化道病变相关的代谢改变（图 3A）。作者发现，反映局部微环境，唾液差异代谢物数量在LGIN阶段早期达到峰值（80种代谢物），与初始微生物变化一致（图 3D），且羧酸及其衍生物、肽及其类似物相关代谢物，表现出以耗竭为主的模式，提示唾液微环境中肽和氨基酸相关代谢的早期重塑。而对于血浆代谢物，作者发现会有延迟的现象，如在HGIN阶段的差异代谢物数量达到峰值（40种代谢物）（图 3E）。这些结果说明，代谢失调起始于早期癌变发生过程中的口腔局部，随后在高级别病变阶段才触发可检测到的系统性反应。进一步按解剖部位重新分组后，UGIC进展过程中鉴定的主要代谢组学特征大体得以保留。随后，作者通过模糊C聚类分析发现，在唾液代谢组中，主要模式为U型轨迹，其特征是LGIN阶段代谢物显著耗竭，随后在HGIN和UGIC中恢复或发生明显转变。该聚类的主要成分包括氨基酸、肽和长链脂肪酸，提示癌前微环境中潜在的消耗表型（图 3F）。而血浆代谢组在HGIN阶段周围显示出更复杂的波动，并呈现反向U型模式，凸显了HGIN阶段类固醇及其衍生物的耗竭（图 3G）。这些结果说明了HGIN作为关键代谢转折点的地位，标志着从局部营养物质耗竭向系统性脂质和类固醇代谢重编程的转变。

图3 UGIC进展过程中局部与全身代谢景观的阶段特异性转变

通过整合宏基因组与代谢组数据，作者发现所有亚组中唾液微生物组与唾液代谢组之间存在一致的整体相关性（图 4A），而唾液微生物组与血浆代谢组之间的一致性总体较弱，仅在LGIN阶段观察到显著相关性。此外作者发现，Bacteroidetes（拟杆菌门）和Bacillota（厚壁菌门）与羧酸及其衍生物表现出最强的相关性（图 4B）。Peptostreptococcus stomatis在整个LGIN-HGIN-UGIC进展过程中均表现出与代谢物的一致正相关，凸显其作为与代谢失调相关的持续性微生物标志物的作用。并观察到Bacillota与多种血浆代谢物表现出相关性（图 4C）。另外，Parvimonas micra在HGIN阶段特异性地与多种二酰甘油表现出显著正相关。这提示P. micra的耗竭可能有助于解释脂质代谢重编程。

图4 唾液微生物群与多种生物体液代谢组学关联的整合分析

通过溯源分析，作者发现11种唾液和9种血浆代谢物完全来源于微生物群，通路富集分析表明，唾液中的色氨酸代谢和血浆中的赖氨酸降解为显著的微生物参与通路（图 5A、B）。重要的是，色氨酸代谢和赖氨酸降解通路主要由唾液和血浆共代谢所富集，强调代谢变化并非仅由微生物作用所致，而是反映了改变的宿主-微生物功能相互作用。通过对宏基因组的GO富集分析发现，脂肪酸降解、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解等氨基酸代谢与脂质代谢相关功能，在LGIN和HGIN组中显著富集（图 5C）。随后，作者利用KEGG数据库中记录的既定代谢反应发现，结果反映了向Acetyl-CoA的分解代谢通量加速。具体而言，在赖氨酸降解通路中（图 5D），关键代谢物底物D-Lysine（D-赖氨酸）和L-Pipecolate（L-哌可酸）在病变组中显著耗竭。同时，编码必要分解代谢酶（包括gabT、gabD等）的微生物基因在LGIN或HGIN阶段显著富集。综合来看，赖氨酸和色氨酸相关底物的耗竭以及参与这些分解代谢通路的微生物基因的富集，提示LGIN和HGIN中微生物相关的氨基酸分解代谢潜力增强，并汇聚于Acetyl-CoA相关代谢节点。这种汇聚并不表明微生物直接释放Acetyl-CoA，而是提示一种潜在途径，即失调的唾液微生物群可能通过产生乙酸、其他短链脂肪酸或相关有机酸等可交换代谢中间产物来重塑局部代谢，这些中间产物随后可进入宿主的Acetyl-CoA代谢。

图5 乙酰辅酶A相关的微生物-代谢改变与多组学分类性能

为将宏基因组学和代谢组学发现转化为非侵入性诊断分类器，以用于内镜检查分流。作者构建了随机森林分类模型，使用五组特征集——流行病学危险因素、唾液微生物群、唾液代谢物、血浆代谢物以及整合的多组学组合——来区分LGIN、HGIN和UGIC与正常。整合多组学模型在癌前病变诊断中表现出优异的诊断性能，LGIN的AUC最高达0.83（图 5E）。整合模型的性能源于跨疾病阶段局部和系统性生物标志物的互补性。在LGIN分类中，排名靠前的特征主要为唾液代谢物，包括Leu−Pro−Ala、Phenylalanyl-Lysine和Serylalanine。这些代谢物此前已被鉴定为某些癌症类型的潜在标志物，进一步证实了唾液氨基酸代谢物在LGIN阶段的关键作用。结果表明，整合唾液特征（对早期局部菌群失调敏感）与血浆特征（对系统性代谢重编程敏感）对于在整个UGIC进展谱中实现精确的、分期特异性的诊断至关重要。