缺血性脑卒中再通后，相当一部分患者仍因继发性脑缺血再灌注（I/R）损伤遗留持续神经功能缺损，其核心病理环节之一是突触结构崩解与随之发生的神经元凋亡。病理性 Ca²⁺超载可驱动突触支架蛋白 DLG4（PSD-95）异常磷酸化，触发 DLG4–AMPA 复合体解离与突触失效；然而，将 Ca²⁺信号转化为 DLG4 异常磷酸化的具体激酶通路——DLG4 究竟被何种激酶、在哪个位点直接磷酸化——长期不清。葛根素虽在实验性缺血模型中显示神经保护，但其能否直接靶向该突触激酶以阻止磷酸化依赖的 PSD 失稳，尚待阐明。

2026年3月，浙江中医药大学袁小凤团队在 Phytomedicine（IF 11.3）发表研究，通过整合DIA蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学与激酶–底物富集分析（KSEA），锁定 CaMKIIδ 经 Thr287 自磷酸化异常激活为 I/R 损伤海马的关键致病介质；并筛选发现葛根素为 CaMKIIδ 候选抑制剂，证实其锚定 ATP 结合口袋、直接抑制激酶活性。进一步发现，突触支架 DLG4 的 Ser654 是 CaMKIIδ 此前未知的直接磷酸化位点，其病理性磷酸化导致 AMPA 受体解离与神经元凋亡。葛根素在 PC-12 兴奋性毒性模型与 MCAO （脑缺血再灌注损伤动物模型）大鼠模型中均可抑制 CaMKIIδ 激活、阻断 DLG4-Ser654 磷酸化、恢复突触稳定性并减轻梗死与神经缺损；该效应被 CaMKIIδ 沉默或特异性抑制剂 KN-93 严格封阻（occlusion），证实其为 on-target 效应。该研究首次阐明 CaMKIIδ–DLG4–AMPAR 病理级联，并将葛根素确立为结构导向的 CaMKIIδ 天然抑制剂候选。

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1. 整合多组学分析锁定异常的 CaMKIIδ-Thr287 磷酸化是脑缺血再灌注损伤的关键驱动因素

为了全面阐明脑I/R损伤的分子病理机制并识别潜在的干预靶点，研究团队对假对照组和缺血/再灌注损伤（模型组）大鼠的海马组织开展 DIA蛋白质组学与磷酸化修饰蛋白质组学，并进行联合分析。

PCA 图显示两组样本明显分离；火山图结果表明，磷酸化层面的改变（2683 个差异位点）在数量与幅度上都远超蛋白丰度改变（991 个差异蛋白），提示磷酸化紊乱是 I/R 早期的突出特征。GO/KEGG 富集分析显示，差异磷酸化蛋白主要富集于突触密度、谷氨酸能突触与钙信号通路。KSEA 进一步显示 CaMKII 家族激活信号最强，其中 CaMKIIδ（CAMK2D）的标准化富集分数（NES）最高。对 CaMKII 四个亚型的总蛋白与自磷酸化位点进行比较后发现：各亚型总蛋白水平均无显著差异，仅 CaMKIIδ 自抑制区Thr287 位点特异性上调，而 CaMKIIα Thr286 未被检出、其余亚型亦无明显变化。综上，I/R 并不改变 CaMKII 总蛋白丰度，而是特异性诱导 CaMKIIδ-Thr287 过度自磷酸化并持续活化，提示 CaMKIIδ 是 I/R 损伤的核心驱动靶点。

图1. 蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学联合分析显示 I/R 海马磷酸化紊乱显著，CaMKIIδ 经 Thr287 自磷酸化异常激活

2. 集成深度学习虚拟筛选将葛根素锁定为 CaMKIIδ 潜在抑制剂

为从天然产物中发掘 CaMKIIδ 抑制剂，作者构建了集成深度学习筛选模型（CNN + RF + SVM，权重 0.4:0.4:0.2）。在测试集上，RF、SVM、CNN 的 AUC 分别为 0.94、0.92、0.92，集成模型 AUC 达 0.94，优于任一单模型。将该模型应用于 COCONUT 天然产物数据库筛选后，输出预测抑制概率最高的前 5 个候选分子，葛根素位列第 4。

图2. 集成深度学习虚拟筛选流程及模型性能评估

3. 葛根素改善 MCAO 大鼠神经功能并减轻脑损伤

为了评估葛根素在缺血性脑卒中中的治疗潜力，我们在MCAO再灌注大鼠模型中评估了不同剂量葛根素给药的效果（图3A）。MCAO 大鼠按 50、100、200 mg/kg（Pue-L/M/H）灌胃给药 7 天。mNSS 评分显示，I/R 组神经功能缺损严重，三个剂量组评分随给药时间与剂量增加而下降；TTC 染色显示 I/R 组梗死灶明显，葛根素可缩小梗死体积。组织学上，H&E 显示 I/R 海马 CA1 区神经元排列紊乱、核固缩、空泡化（Pue-H 改善最明显），Nissl 与 TUNEL 分别显示神经元丢失与凋亡增多，葛根素均减轻。Western blot 显示 I/R 上调 Bax 与 Cleaved Caspase-3、下调 Bcl-2，葛根素逆转该失衡。

图3. 葛根素改善 MCAO 大鼠神经功能、减轻脑损伤并逆转凋亡相关蛋白表达、

4. 磷酸化修饰蛋白质组学揭示葛根素通过抑制 CaMKIIδ 及其下游突触蛋白的磷酸化来发挥作用

为了阐明葛根素的神经保护作用的分子机制，研究团队进一步比较了模型组与葛根素处理组（Pue）的蛋白质组学和磷酸化修饰蛋白质组学结果。PCA 结果显示葛根素显著改变了海马的蛋白质与磷酸化修饰谱；火山图显示磷酸化位点在 Pue 组广泛下调，提示其主要抑制激酶活性。GO/KEGG 富集分析显示，葛根素调控的差异磷酸化蛋白同样富集于突触密度、谷氨酸能突触与钙信号通路。针对 CaMKIIδ 的富集分析表明，其底物在模型组磷酸化水平升高、Pue 组被显著逆转，且 Thr287 磷酸化水平明显降低；PPI 蛋白互作网络分析显示 CaMKIIδ 与 DLG4（PSD-95）直接互作。上述结果提示葛根素通过调控 DLG4 磷酸化影响突触稳定性。

图4. 磷酸化修饰蛋白质组学揭示葛根素显著改变 I/R 大鼠海马磷酸化修饰谱，并抑制 CaMKIIδ 及其下游突触蛋白磷酸化

5. 葛根素阻断 CaMKIIδ 介导的 DLG4 磷酸化、恢复 DLG4–GluR1 相互作用

为验证葛根素对 CaMKIIδ–DLG4 轴（DLG4/PSD-95 作为突触后 AMPA 受体支架）的直接作用，研究团队在体内外检测了 CaMKIIδ 活化状态与 DLG4 磷酸化水平，并考察 DLG4 与 GluR1 的相互作用。Western blot 结果显示，I/R 显著升高 p-CaMKIIδ-Thr287 磷酸化水平，葛根素呈剂量依赖地抑制该位点磷酸化；免疫荧光结果显示，活化的 p-CaMKIIδ 定位于神经元（NeuN+），并与 DLG4 紧密共定位。Co-IP 实验显示，I/R 升高了 DLG4 的丝氨酸磷酸化水平，葛根素可逆转这一变化；与 DLG4 共沉淀的 GluR1 在 I/R 组明显减少（提示复合体解离），葛根素可恢复二者结合，而对 GluR2 无明显影响。上述结果提示，葛根素通过抑制 CaMKIIδ 活化、阻断 DLG4 异常磷酸化及 DLG4–GluR1 解离，从而挽救缺血诱导的 AMPA 受体丢失。

图5. 葛根素阻断 CaMKIIδ 介导的 DLG4 磷酸化并恢复 DLG4–GluR1 相互作用

6. 分子模拟、SPR 与体外激酶实验证实葛根素直接结合并抑制 CaMKIIδ

为阐明葛根素与 CaMKIIδ 的直接结合关系，研究团队开展了分子模拟、SPR 与体外激酶实验。HPLC 分析表明，在病理状态下葛根素可入血并分布至脑组织。分子模拟结果显示，Gly21 为关键结合热点，G21A 突变会显著改变结合模式；分子动力学模拟显示，葛根素与野生型（WT）CaMKIIδ 的结合较 G21A 突变体更稳定、氢键更多且更持久；MM-PBSA 结合自由能计算显示，WT 结合自由能为 −128.237 kJ/mol、G21A 为 −105.478 kJ/mol。SPR 实验证实，葛根素以浓度依赖的方式直接、可逆地结合重组 CaMKIIδ，解离常数 KD = 1.79 μM（ka = 9.25×10³ M⁻¹s⁻¹，kd = 1.66×10⁻² s⁻¹）。体外激酶实验（以 UPLC-MS/MS 监测 AC-2 消耗）进一步证实葛根素抑制 CaMKIIδ 激酶活性。上述结果提示，葛根素可直接结合并抑制 CaMKIIδ 激酶活性。

图6. 葛根素可入血并分布至脑组织，分子模拟与 SPR 证实其直接结合 CaMKIIδ ATP 口袋

7. 计算预测与体外重构 LC-MS/MS 首次证实 Ser654 为 CaMKIIδ 直接磷酸化 DLG4 新位点

为确定 CaMKIIδ 直接磷酸化 DLG4 的具体位点，研究团队以 GPS 6.0 预测得分最高的 Ser654 为重点开展了体外重构验证。将重组 DLG4（3 μg）与 CaMKIIδ（100 nM）共孵育，在 ATP 驱动下反应 90 min 后，以 LC-MS/MS（timsTOF）分析，结果证实 CaMKIIδ 可直接磷酸化 DLG4 的 Ser654；100 μM 葛根素可抑制该磷酸化事件。这是首次以生化手段证明 Ser654 是 CaMKIIδ 直接磷酸化 DLG4 的新位点；病理性 DLG4-Ser654 磷酸化与 AMPA 受体（GluR1/2）解离及线粒体依赖性神经元凋亡密切相关。

图7. GPS 6.0 预测与体外重构 LC-MS/MS 确证 Ser654 为 CaMKIIδ 直接磷酸化 DLG4 的新位点

8. 体内外封阻实验确认 CaMKIIδ 抑制是核心机制

为在整体水平确认 CaMKIIδ 抑制是葛根素的核心作用机制，研究团队开展了体内外封阻（occlusion）实验。封阻实验显示，在 MCAO 大鼠与 PC-12 NMDA 模型中，葛根素与 CaMKIIδ 抑制剂 KN-93 联用未产生叠加保护（效应相互封阻），提示二者作用于同一通路；以 siRNA 敲低 CaMKIIδ 可复制葛根素的保护表型，且联用无叠加效应。在 PC-12 模型中，葛根素抑制 CaMKIIδ 活化、阻断 DLG4-Ser654 磷酸化、恢复 DLG4–GluR1 相互作用并减轻神经毒性损伤。上述结果确证，特异性抑制 CaMKIIδ 是葛根素减轻脑 I/R 损伤的核心机制。

图8. PC-12 NMDA 兴奋性毒性模型中葛根素与 KN-93 相互封阻，提示二者作用于同一通路

图9. siRNA 敲低 CaMKIIδ 可复制葛根素的保护表型，且与葛根素联用无叠加效应

图10. MCAO 大鼠中 KN-93 与葛根素联用未产生叠加保护，进一步验证 CaMKIIδ 为核心靶点

本研究整合蛋白质组学、磷酸化修饰蛋白质组学、深度学习虚拟筛选、分子动力学模拟与体内外验证，首次揭示 CaMKIIδ–DLG4–AMPAR 病理级联，并阐明葛根素的作用机制，其科学意义主要体现在三方面：

① 借助磷酸化蛋白质组与 KSEA，将 CaMKIIδ（而非 CaMKII 家族整体）经 Thr287 自磷酸化特异性活化锁定为 I/R 损伤海马的关键驱动，突破了既往将 CaMKII 视为单一整体的认知；

② 通过体外重构激酶体系联合 LC-MS/MS，首次以生化手段确证 DLG4 的 Ser654 是 CaMKIIδ 直接磷酸化的新位点，从而解释了 DLG4–AMPA 受体解离这一突触失效的核心环节；

③ 首次证实葛根素是 CaMKIIδ 的新型直接抑制剂，可锚定其 ATP 结合口袋抑制激酶活性（KD = 1.79 μM）。

该研究不仅改写了对 CaMKII 家族亚型功能的传统理解（δ 亚型既往被认为主要定位于心脏等非神经组织），也为缺血性脑卒中的精准干预提供了新靶点与候选药物。

图11. CaMKIIδ–DLG4–AMPAR 病理级联及葛根素干预机制示意图