2026年9月，四川大学华西口腔医院等团队在Nature Communications（IF=18.1）上发表了题为“Vascular and lymphatic dysregulation via non-EndoMT Col2a1 signaling in bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw”的研究论文。研究整合全器官组织透明化三维成像、单细胞转录组与蛋白质组学，构建了小鼠与人BRONJ下颌骨微环境的多模态图谱，揭示了血管与淋巴管的显著稀疏化以及4种内皮细胞亚型的异常Col2a1上调。成纤维细胞与巨噬细胞被鉴定为内皮细胞的关键互作对象，凸显了内皮-基质-免疫轴的失调；与稳态下的Dmp1⁺/Tfap2a⁺成纤维细胞和Stab1⁺巨噬细胞不同，BRONJ病灶中出现病理性的Lrrc15⁺/Chad⁺成纤维细胞与Il6⁺巨噬细胞，驱动异位软骨生成与炎症。机制上，COL2A1-CD44轴（内皮-成纤维/巨噬细胞信号）与COL2A1-SDC4轴（内皮-成纤维细胞信号）在BRONJ条件下显著上调，而谱系追踪排除了内皮-间充质转化（EndoMT），提示细胞外基质重塑是核心机制；研究通过局部Col2a1 siRNA沉默与内皮特异性基因敲除完成了功能验证，并在人下颌骨样本中实现跨物种验证，证实了血管-淋巴管失调、炎症与软骨生成。总体而言，该研究将血管与淋巴管失调确立为BRONJ的标志性特征，并把COL2A1-CD44/SDC4轴确定为潜在的治疗靶点。欧易生物为该研究提供了单细胞转录组测序（scRNA-seq）分析服务。

 研 究 背 景 

双膦酸盐相关颌骨坏死（BRONJ）是抗骨吸收治疗（如唑来膦酸）最严重的并发症之一，临床上表现为骨暴露与坏死，伴疼痛、感染及软组织受累，常进展为病理性骨折和长期颌骨功能障碍；目前缺乏有效疗法，现有处理包括抗菌漱口、全身抗生素、死骨切除与软组织关闭，但复发率仍高，很大程度上源于血管修复的不可逆失败。尽管血管生成受损已被认为参与BRONJ发病，但内皮细胞功能障碍的分子基础及其如何扰动局部微环境仍未被阐明，是核心知识空白。已有证据多依赖二维切片，缺乏空间连续性与器官级背景，难以全面刻画血管网络；骨内淋巴管在体表征不足，非管状LYVE1阳性信号可能反映的是巨噬细胞而非真正的淋巴管，增加了研究难度。同时，药物暴露后内皮细胞亚型的异质性、细胞间通讯及下游信号网络尚未被解析；人源数据稀缺且多为个案，限制了跨物种推论与机制推断。为此，本研究整合全器官三维成像、单细胞转录组与蛋白质组学，基于小鼠与人疾病样本构建BRONJ下颌骨微环境的多模态图谱，刻画内皮亚型的分子程序及其与成纤维细胞、免疫细胞的病理互作，鉴定COL2A1-CD44/SDC4轴为内皮功能障碍与血管-淋巴管失调的核心驱动，为BRONJ提供新的机制框架与潜在治疗靶点。

 技术路线

建立适配牙-颌骨复合体的组织透明化与多尺度成像流程，证实BRONJ中血管与淋巴管显著减少，且微血管塌陷在时间上显著早于骨结构退变。

研究针对含牙与骨的不规则颌骨结构建立了组织透明化与成像流程，包含胶原酶消化、梯度异丙醇脱水与肉桂酸乙酯透明化（图1a），实现全器官光片成像与单细胞分辨率共聚焦成像的结合，可视化上颌骨与下颌骨的内皮网络及α-SMA⁺血管周细胞（图1b、c）；在牙槽骨内进一步区分出EmcnloPodocalyxinhi、EmcnhiPodocalyxinhi、EmcnhiPodocalyxinlo三种空间分布各异的血管亚型（图1d）。

通过腹腔注射唑来膦酸并拔除双侧下颌第一磨牙建立小鼠BRONJ模型（图1e），micro-CT与H&E染色证实死骨形成（图1f）。全器官透明化成像显示BRONJ小鼠EmcnhiCD31hi type H血管及α-SMA⁺动脉显著减少（图1g）；在组织与单细胞水平上，type H血管与LYVE1⁺淋巴管均明显稀疏（图1h），并伴随基底膜成分的大量丢失。

时间序列分析显示，BRONJ小鼠骨坏死的组织学标志（连续空虚骨细胞陷窝）直到第14天才出现，而type H血管在第1天即急剧下降，并在整个14天观察窗内持续受抑，说明微血管塌陷在损伤后立即发生且显著早于骨结构退变；追踪至第3、4周，局部血管抑制持续加重，因此选取拔牙后2周作为机制分析窗口。

图1 牙-颌骨组织透明化成像揭示BRONJ血管与淋巴管改变

Result 2 单细胞图谱鉴定内皮细胞为BRONJ微环境的中心枢纽

构建覆盖12类细胞的下颌骨单细胞图谱，发现内皮细胞数量显著减少、血管信号受损，并同时异常激活成骨与炎症转录程序。

对健康与BRONJ小鼠下颌骨进行单细胞转录组测序，获得34,350个高质量细胞，构建覆盖T细胞、B/前B细胞、NK细胞、中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、造血干细胞、成纤维细胞、红细胞、内皮细胞和树突状细胞的12个主要类群图谱（图2a、b），并通过GO富集验证功能注释。

BRONJ中内皮细胞显著减少（图2c、d），并伴随血管信号受损，其中E-selectin（Esel）轴几乎完全丧失（图2e），经免疫标记进一步证实（图2f）。蛋白互作网络与GSEA显示BRONJ组织中成骨与炎症通路显著激活（图2g），GO分析与免疫组化确认以IL-1通路富集、IL-1β广泛升高为特征的局部炎症状态。

值得注意的是，在数量减少与信号紊乱的双重条件下，内皮细胞同时上调成骨与炎症转录程序（图2h），而其他细胞类型仅呈现单轴偏移；细胞间通讯分析显示内皮细胞向其他细胞群的信号输出显著强于相对较弱的基质-内皮反向通路。

图2 健康与BRONJ下颌骨单细胞图谱

Result 3 内皮细胞异质性与亚型选择性易损

鉴定出AEC、VEC、SEC、LEC四种内皮亚型，BRONJ中四者不同程度减少，呈现亚型选择性易损。

研究先分析了骨内post-arterial type R毛细血管，发现表达Fmo2等type R标志物的内皮细胞同时表达静脉标志物Vwf与Selp，且type R标志物在骨折后表达下降（图2i）。随后在健康与BRONJ下颌骨中鉴定出4种主要内皮亚型：动脉内皮细胞（AEC）、静脉内皮细胞（VEC）、血窦内皮细胞（SEC）和淋巴内皮细胞（LEC）（图3a、b），并在单细胞分辨率下完成表征（图3c）。

SCENIC网络分析提示Esel轴的下调可能由Nfkb1抑制驱动，进而削弱E-selectin介导的免疫细胞沿血管壁的黏附与滚动；针对存在争议的LEC，研究进一步验证其在颌骨内的存在，并通过整合公开的多物种转录组数据集，支持下颌骨LEC在比格犬、小鼠与人中的保守分子特征。

BRONJ中4种内皮亚型均出现不同程度的减少（图3d），提示亚型选择性易损。功能注释显示其角色各异：AEC支持血管-骨发育，VEC调控白细胞募集与外渗，SEC介导脂质代谢，LEC维持淋巴管生成与转运调控（图3e）。

图3 内皮细胞异质性及BRONJ中的病理改变

Result 4 内皮-间质重塑：Lrrc15⁺/Chad⁺成纤维细胞异常软骨化

成纤维细胞是内皮信号的主要接收者，BRONJ中Lrrc15⁺与Chad⁺成纤维细胞选择性扩增，并转向以异常软骨生成和基质失衡为特征的病理终末状态。

CellChat分析显示BRONJ微环境的细胞间通讯整体增强，成纤维细胞成为内皮信号的主要接收者（图4a、b）；内皮与成纤维细胞共同上调Col2a1、Comp、S100a9、S100a8等基因，且成纤维细胞上调基因富集于软骨发育通路，提示向软骨化重塑转变。

研究进一步鉴定出8种成纤维细胞亚型，包括Cxcl5⁺、Tfap2a⁺、Lrrc15⁺、Chad⁺、Acta2⁺、Dmp1⁺、Cxcl12⁺和Pi16⁺成纤维细胞（图4c）。对照中以Tfap2a⁺与Dmp1⁺成纤维细胞为主，而BRONJ中Lrrc15⁺与Chad⁺成纤维细胞选择性扩增（图4d），并表现出异常增强的信号互作。

拟时序分析显示这些亚型向以异常软骨生成和基质失衡为特征的病理终末状态演进（图4e、f），免疫荧光证实BRONJ组织中CHAD⁺成纤维细胞扩增（图4g）；该亚型与既往报道的matrifibrocyte（基质纤维细胞）标志谱一致。这些结果提示BRONJ并非单一细胞类型功能障碍，而是内皮衰退与间质异常交织的复杂病理网络。

图4 成纤维细胞异质性与内皮-间质失调

Result 5 内皮-巨噬细胞促炎耦联与免疫失衡

内皮细胞由血管稳态转向促炎程序，Il6⁺巨噬细胞取代Stab1⁺巨噬细胞，形成异常放大的内皮-巨噬细胞促炎耦联轴。

SCENIC分析显示对照内皮细胞富集血管生成相关转录因子，而BRONJ内皮细胞显著富集免疫与炎症相关转录因子（图5a），提示由血管稳态向促炎转录程序转变，并伴随内皮-巨噬/树突细胞通讯增强（图5b、c）；与此同时，巨噬细胞谱系在BRONJ中广泛上调炎症基因，与内皮细胞的促炎转录谱高度一致。

巨噬细胞亚聚类鉴定出增殖型巨噬细胞、树突状细胞、MHCII⁺、Il6⁺与Stab1⁺巨噬细胞5种状态（图5d）。对照中以参与脂蛋白稳态的Stab1⁺巨噬细胞为主（图5e、f），BRONJ中该群体被显著扩增且呈强炎症表型的Il6⁺巨噬细胞取代，免疫标记也验证了BRONJ病灶中IL-6升高（图5h）。

拟时序分析显示增殖型巨噬细胞分化为树突状细胞与成熟巨噬细胞，后者在对照中偏向Stab1⁺终末状态、在BRONJ中偏向Il6⁺状态（图5g）。代谢分析显示对照Stab1⁺巨噬细胞通过鞘脂与多糖代谢维持膜与细胞外基质稳态，而BRONJ Il6⁺巨噬细胞激活能量代谢，提示应激驱动的重编程（图5i）。此外，除Cd8⁺T细胞外所有NK/T细胞亚型及B/前B细胞在BRONJ中均明显减少，提示固有与适应性免疫区室同时受损。

图5 BRONJ中内皮-巨噬细胞促炎重塑

Result 6 Col2a1驱动间质与免疫失调：谱系追踪排除EndoMT并完成功能验证

COL2A1-CD44/SDC4轴在BRONJ中显著上调；谱系追踪证实血管-间质重塑并非由EndoMT驱动，而是内皮源性Col2a1的旁分泌作用，并经局部siRNA与内皮特异性敲除完成因果验证。

CellChat分析显示4种内皮亚型向成纤维细胞/巨噬细胞状态的通讯全面增强，胶原信号占主导（图6a），其中COL2A1-CD44轴（内皮-成纤维/巨噬细胞信号）与COL2A1-SDC4轴（内皮-成纤维细胞信号）在BRONJ条件下尤为突出（图6b）；同时BRONJ基底膜IV型胶原丢失。Col2a1在所有内皮亚型中显著升高（图6c），血管周II型胶原沉积在BRONJ拔牙窝内累积并与内皮细胞局灶共定位（图6d）；RT-qPCR证实Col2a1、Cd44、Sdc4转录本同步上调，且该串扰的放大早于第56天（拔牙后14天）的组织学坏死。

IV型胶原减少提示内皮特征丢失，而I/II型胶原异常升高提示成纤维细胞样分泌活性，由此引出EndoMT可能。基于EC-成纤维细胞连续谱的拟时序分析未观察到Snail1、Snail2等经典EndoMT标志物的显著诱导（图6e）；在Cdh5-2A-CreERT2;Rosa26-LSL-td-Tomato BRONJ小鼠中进行谱系追踪（图6f），发现超过99%的I型和II型胶原沉积为tdTomato阴性，有力排除了EndoMT。因此，内皮细胞并非通过EndoMT，而是通过异常的Col2a1信号作为旁分泌枢纽，经COL2A1-CD44/SDC4轴促进细胞外基质重塑与炎症。

在功能验证层面，体外直接用唑来膦酸处理HUVEC与LEC可诱导细胞骨架破坏并细胞自主性上调Col2a1，支持不依赖基质的内皮细胞自主反应；体内通过光交联GelMA水凝胶在拔牙窝局部递送Col2a1 siRNA，有效挽救BRONJ表型，促进软组织愈合与拔牙窝成骨。为分离内皮细胞的特异性贡献，研究通过Cdh5-Cre-Tg与Col2a1fl/fl杂交构建内皮特异性条件敲除（Col2a1iΔEC）小鼠（图6g），内皮Col2a1的基因缺失带来更优的血管形态学恢复（图6h）。scTenifoldKnk虚拟敲除从计算层面印证，内皮Col2a1缺失会系统性扰动血管生成、炎症与成骨相关的下游基因调控网络；局部siRNA与Col2a1iΔEC小鼠均挽救了成骨与血管生成，且该干预下调Sdc4与Cd44。

图6 内皮源性Col2a1驱动BRONJ发病的机制研究与功能遗传验证

Result 7 人BRONJ样本跨物种验证血管-淋巴管缺陷与COL2A1轴

人BRONJ下颌骨样本中血管与淋巴管显著减少、CHAD⁺成纤维细胞扩增，蛋白质组与转录组共同支持以内皮为中心的骨基质-炎症致病过程。

对人BRONJ样本进行蛋白质组分析与血管-淋巴管成像（图7a）。蛋白质组呈系统性衰减模式，总蛋白数量明显减少、广泛下调而有限上调；下调蛋白富集于血管生成与成骨功能，上调蛋白聚集于炎症通路（图7b），提示炎症增强、内皮功能障碍与骨形成受损。值得注意的是，基质金属蛋白酶（MMP）家族成为蛋白互作网络中的上调枢纽，可通过降解基底膜成分与II型胶原等细胞外基质纤维，促进白细胞跨内皮迁移，破坏内皮-免疫稳态。

针对人骨成像困难的问题，研究克服了常规酸脱钙造成的抗原丢失并整合组织透明化步骤，建立了人骨血管网络的三维成像方法（图7a、c）。组织学证实了典型BRONJ死骨病变并揭示内皮损伤（图7d）：CD31⁺CD34⁺微血管密度显著降低，CD31⁺α-SMA⁺动脉受损，CD31⁺LYVE1⁺淋巴管也显著减少，同时再次观察到CHAD⁺成纤维细胞的病理扩增（图7e），在跨物种背景下验证了内皮-间质失调。

进一步的人源bulk RNA-seq所得转录组特征与小鼠数据总体一致，表现为炎症与细胞外基质重塑通路激活、血管-成骨程序受损，支持以内皮为中心的骨基质-炎症致病过程。

本研究整合高分辨率三维成像、单细胞转录组与蛋白质组学，系统刻画了小鼠模型与人下颌骨标本的BRONJ微环境，构建了跨物种图谱。在组织层面，证实BRONJ存在显著的血管与淋巴管损伤；在单细胞层面，鉴定出4种内皮、4种成纤维细胞与2种巨噬细胞亚型为BRONJ进展的关键驱动者；在分子层面，明确COL2A1-CD44轴（内皮-成纤维/巨噬细胞信号）与COL2A1-SDC4轴（内皮-成纤维细胞信号）协调血管、间质与免疫病理网络。研究通过局部Col2a1 siRNA与内皮特异性敲除，将相关性推进为因果证据，证明内皮源性Col2a1是BRONJ发病的重要细胞自主性介质与潜在分子靶点。该工作将BRONJ从“血管生成受抑”的单一认识，重构为以血管-淋巴管退化、基质重塑与免疫失衡为特征的多维疾病，并提出三条互补的转化方向：血管保护与基底膜重建、重塑间质-免疫微环境、以及阻断COL2A1-CD44/SDC4旁分泌信号轴，有望推动BRONJ管理从被动清创转向主动恢复微环境稳态。

Shi, Y., Sun, H., Guo, Z., Liu, X., Pei, X., Wang, J., Yu, F., Peng, X., Yuan, Q., Kusumbe, A. P., Chen, J. Vascular and lymphatic dysregulation via non-EndoMT Col2a1 signaling in bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw. Nature Communications, 2026. https://doi.org/10.1038/s41467-026-77692-w