前言
2019年11月，第二军医大学张冬梅、潘卫庆课题组在Journal of Hepatology杂志（IF=18.946）发表题为“A schistosome miRNA promotes host hepatic fibrosis by targeting transforming growth factor beta receptor III”的研究论文，该研究首次证明了寄生虫miRNAs在血吸虫病相关肝纤维化的发展过程中以跨物种的方式起直接调控作用，为研究肝脏血吸虫病的病理机制提供了新的思路。
基本信息
英文标题：A schistosome miRNA promotes host hepatic fibrosis by targeting transforming growth factor beta receptor III
中文标题：血吸虫miRNA通过靶向转化生长因子β受体III促进宿主肝纤维化
发表期刊：Journal of Hepatology
影响因子：18.946
文中转录组测序和smallRNA测序由欧易生物完成。
研究背景
血吸虫病是普遍的热带传染病之一，影响着78个国家的2.4亿多人。引起人类肝病的两个重要的物种是曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni ）和日本血吸虫（Schistosoma japonicum (S. japonicum)），存活在宿主肠系膜静脉中的雌性血吸虫产下大量的卵，其中许多通过门静脉系统被困在肝脏中。寄生虫卵会释放高免疫原性物质，诱导肉芽肿和纤维化反应，促进肝星状细胞(HSCs)转分化为活化的肌成纤维细胞，导致肉芽肿部位胶原的产生和纤维化的形成。microRNAs（miRNAs）是在动物、病原体和植物中发现的一组高度保守的非编码小RNA分子，在几乎所有的发育、生理和病理过程中都起着重要的作用。目前已有一些研究报道某些物种（如水稻、真菌）的miRNAs能够起到跨物种调控的作用，但尚无实验性证据证明病原体的miRNAs在感染过程中参与宿主疾病的发生和发展。
研究内容
研究者从血吸虫感染的小鼠肝脏中分离出原代HSCs，通过small RNA测序及转录组测序，从中鉴别出寄生虫来源的miRNA，其中包括sja-miR-2162。体外转染sja-miR-2162模拟物能够激活HSC细胞，主要表现为胶原和α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）的升高。通过rAAV8介导将sja-miR-2162转染至幼稚小鼠体内可以诱导肝纤维化，而持续抑制sja-miR-2162可减轻血吸虫感染小鼠的肝纤维化。随后，研究者通过实验验证了转化生长因子β受体3（TGFBR3），一种TGF-β信号的负性调节因子，是sja-miR-2162在HSCs中的直接靶点。该研究表明病原体来源的miRNAs以跨物种的方式直接促进肝纤维化的形成，其有效和持续的抑制可能为感染性疾病提供一种有前途的治疗干预措施。
研究路线
研究结果
1、参与调节宿主肝纤维化的sja-miRNAs的鉴定
研究者首先从血吸虫感染的小鼠中分离出原代HSCs，通过RNA测序和small RNA测序鉴定宿主HSCs中存在的sja-miRNAs，以确定可能参与宿主肝纤维化的潜在sja-miRNAs。对转录组测序数据进行分析，从中不能检测到寄生虫的两个高表达基因，证明测序文库中并无寄生在宿主肝组织中的虫卵的RNA污染。对small RNA测序结果进行分析，从中鉴定出8个与血吸虫miRNA序列完全匹配的sja-miRNAs（图S1）。接下来，研究者合成了51个sja-miRNAs的模拟物，转染大鼠HSC细胞系HSC-T6，从中鉴定出17个sja-miRNAs能够上调纤维化相关基因的表达，其中，sja-miR-2162是唯一能上调所有检测到的HSC激活相关基因表达的寄生虫特异性miRNA，并且同时能在宿主的HSCs中检测到。因此，研究者选择sja-miR-2162进一步研究其在血吸虫病相关肝纤维化中的作用。
图S1 RNA-seq鉴定宿主HSCs中8个寄生虫miRNA的信息
2、过表达sja-miR-2162体外诱导宿主HSCs活化，并促进幼稚小鼠肝纤维化
为进一步探究sja-miR-2162的作用，研究者构建了sja-miR-2162的过表达质粒。首先用过表达质粒转染了不同物种的HSCs细胞系，包括人、小鼠和大鼠，均促进了HSCs的活化，体现为纤维化相关基因Col1α1、Col3α1 和α-Sma 表达量上调（图1A）。随后作者为进一步探究sja-miR-2162的过表达是否能诱导小鼠肝纤维化，对幼稚小鼠静脉注射了过表达sja-miR-2162的腺相关病毒载体（rAAV8-pri-sja-miR-2162）、对照病毒（rAAV8-SCR）以及PBS，在注射后第40天和第100天，过表达sja-miR-2162的小鼠出现了肝纤维化，表现在羟脯氨酸含量和纤维化相关基因的表达显著提高（图1B-C），细胞外基质（ECM）沉积在注射后第100天显著增加（图1D）。进一步分离注射小鼠的原代HSCs进行qPCR定量，过表达sja-miR-2162的小鼠的HSC中纤维化相关基因的表达相比对照组出现显著上调（图1E）。这些结果表明sja-miR-2162在体内促进肝纤维化。
图1 | sja-miR-2162过表达诱导幼稚小鼠肝纤维化
3、抑制sja-miR-2162延缓血吸虫病相关肝纤维化的进展
为了研究sja-miR-2162是否参与了血吸虫病相关肝纤维化的发展过程，研究者构建了一种能够海绵sja-miR-2162的腺相关病毒载体（rAAV8-anti-sja-miR-2162-sponge vector），该海绵载体可以通过与sja-miR-2162结合来抑制sja-miR-2162的功能。研究者将小鼠暴露在温和剂量的寄生虫中，同时用海绵载体或对照载体进行治疗。在感染后8周和10周，注射海绵载体的小鼠与注射对照载体的小鼠相比，细胞外基质沉积以及肝肉芽肿的大小都出现显著减少（图2A-D），小鼠肝脏中纤维化相关基因的表达也呈现显著下调（图2E）。并且载体处理并不会影响寄生虫在宿主体内的存活和产卵（图2F）。进一步从小鼠中分离原代HSCs进行定量，同样发现HSC活化的标志物也出现显著下调（图2G）。直接使用sja-miR-2162抑制剂转染从寄生虫感染小鼠中分离的HSCs，也显示出相同的表型（图2H）。综上所述，这些结果表明，在血吸虫病期间，寄生虫分泌的sja-miR-2162可以进入肝星状细胞胞浆，促进肝星状细胞的活化和肝纤维化，而通过抑制sja-miR-2162可以显著改善肝纤维化的进展。
图2 | 抑制sja-miR-2162延缓血吸虫病相关肝纤维化的进展
4、sja-miR-2162通过靶向TGFBR3介导宿主HSCs的激活
为进一步研究sja-miR-2162介导宿主HSCs激活的分子机制，研究者对转染了sja-miR-2162模拟物的HSCs进行了转录组测序，从中鉴别出显著下调的基因，并通过miRDB数据库预测了sja-miR-2162的靶基因（图3A），满足两者条件的只有2个基因（Pcdh9 和Tgfbr3 ），而其中TGFBR3是TGF-β信号的负调控因子，在细胞外基质的产生和伤口愈合反应中起重要作用。因此，在上述分析的基础上，研究者选择了Tgfbr3 作为进一步研究的潜在靶基因。首先他们分别分析了sja-miR-2162和TGFBR3在感染小鼠HSCs中的表达，发现sja-miR-2162和TGFBR3 mRNA的表达呈负相关（图3B-C），然后通过荧光素酶报告实验证明了sja-miR-2162和TGFBR3的3’UTR区之间存在直接相互作用。且在HSCs中过表达sja-miR-2162导致TGFBR3的蛋白水平下调，抑制sja-miR-2162导致TGFBR3的蛋白水平上调（图3E-F）。这些结果证明了TGFBR3是sja-miR-2162在宿主HSCs中的直接靶点。
图3 | sja-miR-2162与TGFBR3关系的验证
为了阐明TGFBR3在HSCs活化中的作用，研究者又将TGFBR3 siRNA转染到幼稚小鼠的原代HSCs中，发现siRNA介导的对TGFBR3的敲降明显促进了HSCs的激活（图4A）。与先前关于TGFBR3作为TGF-β/SMAD信号负调控因子的报道一致，当转染TGFBR3 siRNA或者sja-miR-2162模拟物时，HSCs中Smad2和Smad3的磷酸化明显增加（图4B），此外，在注射了sja-miR-2162海绵载体的寄生虫感染小鼠的HSCs中，Smad2和Smad3的磷酸化明显降低（图4C）。这些结果表明，sja-miR-2162通过靶向TGFBR3负调控TGF-β/SMAD信号，介导宿主HSCs的激活和肝纤维化。
图4 | TGFBR3通过抑制SMAD信号阻断HSCs的激活
研究结论
sja-miR-2162是一种血吸虫miRNA，存在于日本血吸虫（S. japonicum ）感染小鼠的肝星状细胞中；
sja-miR-2162靶向宿主Tgfbr3 基因上调胶原和α-SMA的产生；
rAAV8介导的sja-miR-2162转染幼稚小鼠促进肝纤维化；
抑制sja-miR-2162能够减轻感染小鼠的肝纤维化。
参考文献
He X, Wang Y, Fan X, et al. A schistosome miRNA promotes host hepatic fibrosis by targeting transforming growth factor beta receptor III. J Hepatol 2020; 72(3): 519-527.
