基本信息
英文标题：Fatty Liver Disease Caused by High-Alcohol-Producing Klebsiella pneumoniae
中文标题：高产酒精的肺炎克雷伯菌导致脂肪肝
发表期刊：Cell Metabolism
发表时间：2019.09
影响因子：22.415
生物技术：Agilent表达谱芯片（欧易生物提供）、16s微生物多样性测序等
引言
随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，成人NAFLD患病率高达10%～30%，已成为当代医学领域的新挑战。尽管越来越多的证据表明NAFLD与肥胖、代谢和胰岛素抵抗综合征、血脂异常和肠道微生物群的改变密切相关，但其确切机制仍不清楚。
首都儿科研究所袁静教授、中国科学院武汉病毒研究所刘翟教授、军事科学院军事医学科学研究院微生物流行病研究所杨瑞馥教授为共同通讯作者于9月19日在《Cell Metabolism》上发表了一篇研究文章，文章作者在超过60%的NAFLD患者中发现了一种能够大量生产酒精的肠道细菌，通过一系列的功能研究，证明了这种高产酒精的肠道细菌可能导致非酒精性脂肪肝病。该研究结果将有助于开发一种用于NAFLD早期诊断的筛查方法，并为NAFLD治疗提供新的治疗靶点。
研究结果
结果1：发现HiAlc Kpn 是引发NAFLD的潜在因素
研究者对非酒精性脂肪肝炎（NASH）和自动酿酒综合征（ABS）患者在治疗的不同阶段中的粪便样本进行了微生物多样性测序，从中主要发现了7个门的细菌，其中变形杆菌门的分布与血液中的酒精浓度呈现出明显的相关性（Fig 1A），而变形杆菌中的克雷伯菌在患者发病的第一天中丰度高达18.8%，是健康对照组的900倍。研究者通过选择性培养基分离出了两株耐酒精的肺炎克雷伯菌（W14和TH1），并检测了它们的理化性质，将它们命名为high-alcohol-producing Klebsiella pneumoniae（HiAlc Kpn）。随后作者分析了HiAlc Kpn 与NAFLD之间的相关性，发现：NAFLD患者粪便中Kpn 的含量略高于健康人，而NAFLD患者粪便中的Kpn 产出酒精的能力显著强于正常人群，此外，61%的NAFLD患者携带有高产酒精和中产酒精的Kpn（酒精生产浓度>20mmol/l），而对照组中仅有6.25%的个体携带。NASH患者粪便中的酒精含量及Kpn 的产酒精能力显著高于对照组，且在其减肥后呈现出显著的降低。（Fig 1）
Fig 1. HiAlc Kpn 可能引发NAFLD
结果2：HiAlc Kpn 在小鼠中诱导NAFLD
为了探讨高产酒精的细菌与脂肪肝进展的关系，研究者分别给SPF小鼠饲喂HiAlc Kpn 、乙醇及对照培养基，然后检测了各项NAFLD相关的肝脏病理指标并评估了肝脏免疫功能，结果发现仅仅喂食了HiAlc Kpn 一个月，小鼠就长出了脂肪肝；两个月后，小鼠肝脏甚至出现了疤痕——这是一种肝脏长期受损的症状。而且，这种病情的发生和进展和喂食酒精的小鼠几乎是一致的。（Fig 2）
Fig 2. 给小鼠喂食HiAlc Kpn 能够诱导慢性肝脂肪变性
结果3：表达谱芯片揭示HiAlc Kpn 诱导线粒体功能障碍、引起NAFLD发生和发展的动力学过程
线粒体功能障碍在NASH的进程中起到了关键的作用，因此研究者对肝癌细胞进行HiAlc Kpn 培养液上清的处理，诱导脂肪变性，并检测了线粒体的功能，证实了HiAlc Kpn 能够体外诱导线粒体功能障碍，引起肝癌细胞脂肪变性。随后，为了进一步研究HiAlc Kpn 诱导的肝脂肪变性发生和发展的机制，研究者通过Agilent表达谱芯片（由欧易生物提供）检测了HiAlc Kpn 喂食组、乙醇喂食组和对照组在喂食4,6,8周后的肝表达谱情况，发现喂食4周时HiAlc Kpn 喂食组和乙醇喂食组相对于对照组有大量的基因差异表达，而6、8周后差异表达基因有所减少。研究者通过差异基因的KEGG pathway富集分析发现，在早期（4周）时，差异基因主要富集在破骨细胞分化、视黄醇代谢和花生四烯酸代谢，表明早期与肝细胞中的脂肪累积和损伤相关；相对的，6周和8周时，主要富集在不饱和脂肪酸生物合成、甘油脂代谢、视黄醇代谢、FoxO信号通路和PPAR信号通路，这些通路已被证明能够直接驱动游离脂肪酸的增加并导致脂肪肝病。此外，相比于乙醇喂食组，HiAlc Kpn 喂食组的差异基因出现富集在一系列与癌症相关的通路中。而对HiAlc Kpn 喂食组和乙醇喂食组的上调基因进行GO富集分析，发现它们富集在一致的生物学过程中。除了肝脂肪变性外，HiAlc Kpn 喂食组还尤其显著富集于炎症反应中。
总而言之，研究者取了不同喂食时间的HiAlc Kpn 喂食小鼠、乙醇喂食小鼠及对照小鼠的肝组织进行表达谱芯片检测，对不同时间的HiAlc Kpn 喂食组/乙醇喂食组vs 对照组的差异基因的进行分析，通过KEGG pathway和GO的富集分析，分析了HiAlc Kpn 喂食后HiAlc Kpn 引起NAFLD发生发展的动力学变化，以及其与酒精引起的FLD之间的异同。这些结果与前人在NAFLD中观察到的通路一致，符合NAFLD和NASH进程的“two-hit”病理机制假说。（Fig 3）
Fig 3. HiAlc Kpn 在体内外引起线粒体功能障碍
结果4：HiAlc Kpn 是NAFLD的一种主要致病因子
为了探讨Kpn与NAFLD之间的因果关系，研究者进行了粪便微生物群移植（FMT），建立小鼠模型。他们分别使用了含HiAlc Kpn 的NASH患者的肠道菌群、HiAlc Kpn 诱导的NAFLD小鼠的肠道菌群，以及特异性消除了HiAlc Kpn 的NAFLD小鼠肠道菌群，将它们灌胃至健康无菌小鼠体内，发现移植了前两者的小鼠均出现了明显的肝脂肪变性，而喂食消除了HiAlc Kpn 的菌群的小鼠没有出现任何指标的变化。这些结果表明HiAlc Kpn 可能是NAFLD的一个主要致病因素。
此外，使用抗生素亚胺培南治疗HiAlc Kpn 喂食的小鼠，能够减轻它们的病理变化，这进一步提示抗生素治疗可能作为HiAlc Kpn 诱导的NAFLD患者的一种替代疗法。（Fig 4）
Fig 4. HiAlc Kpn 是NAFLD的一种主要致病因子
结果5：不同产酒精能力的Kpn 诱导不同的NAFLD进程
研究者从NAFLD患者和健康对照中分离出了具有高、中、低产酒精能力的另外几种Kpn 菌株，分别喂食小鼠，其中喂食高产酒精的HiAlc Kpn 的小鼠在4周就出现了典型的肝脂肪变性，而喂食中产酒精的MedAlc Kpn 的小鼠直到12周才出现病理变化。此外，与乙醇喂食小鼠比较，发现HiAlc Kpn 在体内定植的作用方式与酒精类似，影响了肠屏障的完整性，诱导了炎症反应。高脂饮食（HFD）与不同产酒精能力的Kpn 联合应用时，不同菌株喂食会产生不同的免疫反应。（Fig 5）
Fig 5. HiAlc和MedAlc Kpn 菌株诱导慢性肝脂肪变性的效应
结果6：高脂高糖饮食加重NAFLD的风险
高脂饮食（HFD）是导致肥胖、2型糖尿病和NAFLD的一个重要因素，研究者在给小鼠喂食HFD都同时进行HiAlc Kpn 灌胃，结果发现，喂食HFD的小鼠肝脂肪变性在2周时就开始出现，且各项病理指标都出现了加强。
此外，为了开发一种新的用于早期NAFLD筛查的内源性酒精检测方法，研究者测量了HiAlc Kpn 喂食和乙醇喂食的小鼠的血液酒精浓度（BAC），发现HiAlc Kpn 喂食小鼠检测不到BAC，而乙醇喂养小鼠已经开始醉酒。考虑到葡萄糖是酒精生产的底物，研究者向HiAlc Kpn 喂养小鼠同时喂食葡萄糖溶液，发现小鼠的BAC出现了显著升高，且开始醉酒。最后，研究者检测了NAFLD患者和健康对照者在口服葡萄糖耐量试验（OGTT）后的BAC，发现NAFLD患者的平均BAC显著高于对照组，且在他们减肥后出现显著下降，提示OGTT后的BAC检测有诊断NAFLD的潜力。（Fig 6）
Fig 6. HFD加重脂肪肝病和纤维化的进程，葡萄糖促进BAC的检测
研究结论
- 1）研究者在超过60%的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）患者中发现了一种能够大量生产酒精的肠道细菌HiAlc Kpn ，并从患者粪便中分离出了这类菌株，通过粪菌移植的手段构建了模型小鼠，证明了这种高产酒精的肠道细菌会导致NAFLD；
- 2）通过表达谱芯片等手段发现HiAlc Kpn 诱导的NAFLD可能与酒精介导的FLD具有相似的分子机制；
- 3）证明了HiAlc Kpn 可能是NAFLD的一种主要致病因素，通过抗生素治疗抑制HiAlc Kpn 有望成为NAFLD的替代疗法；
- 4）发现高脂高糖饮食会加重NAFLD的进展，且口服葡萄糖后测量血液酒精浓度，有望成为NAFLD早期诊断的筛查手段。
参考文献
Jing Yuan, Chen Chen, Jinghua Cui, et al. Fatty Liver Disease Caused by High-Alcohol-Producing Klebsiella pneumoniae. Cell Metabolism. Sep 19, 2019. PMID: 31543403.
