- 前 言 -
单细胞转录组测序（Single cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术在医学研究领域开展地如火如荼，但在植物领域仍方兴未艾。自 2019 年初首篇植物根尖单细胞图谱文章发表在 Plant Physiology 以来，陆续有多篇文章利用单细胞测序技术对植物根尖开展研究，而对植物地上组织的单细胞测序尚未见报道。
2020 年 6 月 24 日，河南大学孙旭武教授课题组在 Molecular Plant 杂志（IF: 12.813）在线发表了题为“Global Dynamic Molecular Profiles of Stomatal Lineage Cell Development by Single-Cell RNA Sequencing” 的文章。该研究首次运用单细胞 RNA-seq 技术解析了拟南芥气孔谱系细胞发育进程中的转录组动态模式。
河南大学刘祉辛博士，博士研究生周亚萍、郭敬功和上海师范大学硕士研究生李姣爱为并列第一作者。文章中单细胞 RNA-seq 测序及数据分析由欧易生物完成。
- 研究背景 -
气孔是由成对的保卫细胞形成的，在植物对陆地的定殖过程中起着至关重要的作用。植物气孔参与调节蒸腾作用以及与环境之间的气体交换。气孔谱系细胞的命运决定是可追踪的，不可逆的，并产生特异的分化细胞类型。因此气孔发育是人们在单细胞水平上研究多种命运特异性遗传程序的相互作用以及外部环境因素对不同细胞类型命运决定的影响的优异模型。尽管气孔谱系细胞发育的调控机制已被广泛研究，但基于单细胞转录组分析对这一生物学过程的全面解析尚未报道。
- 研究技术 -
1. 从 5 日龄拟南芥幼苗子叶中分离原生质体，利用 8% 甘露醇洗涤以去除 Mg2+，利用 40 µm 细胞筛过滤；
2. 利用 Chromium Single Cell 3ʹ Gel Beads-in-emulsion (GEM) Library &Gel Bead Kit v3 试剂盒构建单细胞测序文库；
3. 数据分析：
a) 利用 CellRanger 进行测序数据的质控和比对；
b) 利用 STAR 进行转录本定量；
c) 过滤掉 > 40% counts 比对到叶绿体基因的低质量细胞；
d) 利用 Seurat 对过滤后的数据矩阵进行文库大小均一化；
e) 利用 PCA 对数据进行降维分析，通过基于图形的方法对细胞进行聚类，并使用 tSNE 进行二维可视化；
f) 利用 Monocle 2 进行拟时序分析，利用 Cytoscape 绘制转录因子和靶基因调控网络。
- 研究结果 -
1. 气孔谱系细胞的基因表达模式
从 5 日龄拟南芥幼苗子叶中分离获得的 12,844 个细胞进行单细胞测序，t-SNE 分析显示这些细胞可以分成11个细胞簇，并基于各细胞簇中表达的一致 marker gene 进行了细胞类型的鉴定。同时通过分析不同类型的细胞中特异表达的新 marker genes，解析了不同的细胞簇中基因表达模式，鉴定了每种类型的细胞中显著表达的 marker genes，并以此验证了上述细胞类型鉴定结果。
图片说明：(A) 根据已知 marker gene 表达模式鉴定的细胞类型；(C) marker gene 在各细胞簇中的表达示意图；(D) marker gene 在气孔发育过程中的动态模式分析
图片说明：(A) 每个细胞簇中代表性 marker gene 的表达热图；(B) 每个细胞簇中代表性 marker gene 表达的小提琴图
2. 不同细胞类型富集基因的 GO 分析
为了探究不同细胞类型所表达基因的生物学功能，本研究进行了各细胞簇富集基因的 GO 分析。结果显示，大部分 GO 富集条目与单个细胞类型相关。
图片说明：GMC、LM、EM、MMC 细胞中基因 GO 富集热图
3. 参与气孔谱系细胞早期发育的转录因子调控网络分析
为了研究参与气孔谱系细胞早期发育调控的转录因子，对各细胞类型中高表达的转录因子进行了筛选。结果显示MMC、EM、GMC中转录因子 BPC1、BPC2、BPC4、BPC6、WRKY33 显著高表达（图 B）。BPC 蛋白和 WRKY33 是已知的调控植物幼苗生长、发育和应激响应的重要转录因子。许多功能基因受到 BPC 蛋白和 WRKY33 的调控（图 C），并且 BPC1 和 BPC6 可以调控许多已知的转录因子（图 D）。
图片说明：(A) 各细胞类型中鉴定的转录因子；(B) MMC、EM、GMC 中鉴定的转录因子表达的小提琴图；(C) MMC、EM、LM、GMC 中鉴定的转录因子的调控网络；(D) 已知和新鉴定转录因子的共调控网络
4. WRKY33 和 BPC 参与调节气孔早期发育
为了研究上述转录因子对气孔谱系细胞发育的影响，绘制了转录因子的 feature plots（下图 A）。分析幼苗子叶下表皮的气孔发育模式发现，与野生型相比，wrky33 突变体中 GC 细胞比例降低、M 和 GMC 比例上升（下图 B-D），表明从 M 到 GMC 或 GMC 到 GC 的细胞分化过程存在缺陷。
图片说明：(A) 不同细胞类型中代表性转录因子表达的 feature plots；(B) 野生型对照 WT 和 wrky33 幼苗子叶气孔谱系细胞的发育模式；(C) (D) 根据图 B 计算的细胞类型频率
同样，在 bpc 蛋白突变体中 M 和 GMC 细胞比例上升，但 GC 细胞比例下降，表明 BPCs 蛋白可能参与介导 M 到 GMC 的发育过程。
图片说明：(A) BPC6-GFP的细胞亚定位分析；(B) bpc突变体中 marker gene 定量 PCR 结果；(C) 5日龄 bpc 突变体和转基因植株子叶中气孔谱系细胞的发育模式；(D) (E) 根据图 C 计算的细胞类型频率
5. ATML1 参与调节气孔谱系细胞的发育
为了探索 MMC（分生母细胞）的潜在调节因子，实验分析了 MMC 中的标记基因，结果显示 ATML1 与 HDG2 具有高度相似的表达谱。HDG2 是已报道的 M 到 GMC 细胞分化的重要调节因子，提示 ATML1 可能参与调控气孔细胞早期发育。在 atml1-3 突变体中气孔谱系细胞发育存在缺陷，同时 qPCR 也显示 marker gene SPCH、MUTE 的表达水平低于野生型。表明 ATML1 可能通过调节 SPCH 和 MUTE 的表达来调节气孔谱系细胞的发育。
6. Marker gene 表达的拟时序分析
为了重建分化过程中的发育轨迹，本研究使用 Monocle 2 软件对 scRNA-seq 数据进行了拟时序分析，拟时序路径共有三个分支（图 A、B）。总体来看，从 MMC 到 GC 可以看到气孔谱系细胞的不同发育过程。
选择每个细胞类型 top5 marker gene 分析它们的拟时序表达模式，结果显示，这些 marker gene 可以分为两群（下图 C）。其中 EPF1、SPCH、MUTE 主要在气孔发育早期阶段高表达。
图片说明：(A) 每个细胞簇在拟时序轨迹上的分布；(B) 根据细胞类型着色的拟时序轨迹；(C) 气孔细胞拟时序过程的代表性基因的表达动态分析和聚类
图片说明：(A) 气孔细胞拟时序过程的代表性基因的聚类分析；(B) 气孔细胞拟时序过程的代表性基因的表达动态分析
- 研究结论 -
本研究首次对拟南芥气孔谱系细胞发育过程进行了单细胞转录组测序分析，鉴定了气孔发育过程中各细胞类群显著表达的 marker gene，并分析了其所参与的 GO 功能。为了分析气孔细胞早期发育阶段的基因表达调控机制，构建了气孔分生母细胞中基因表达的转录因子调控网络。进一步通过分析所鉴定的标记基因和转录因子的拟南芥突变体的气孔发育表型，确定了这些基因在调控气孔发育中所扮演的重要角色。本研究，为利用单细胞RNA-测序技术在鉴定新的标记基因，以及解析气孔谱系细胞发育的调控机制提供了新的研究思路和技术体系。
【特别致谢】上海欧易生物医学科技有限公司陆瑶和巴永兵在数据处理中给予的帮助。
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参考文献
Liu Z, Zhou Y, Guo J, et al. GlobalDynamic Molecular Profiles of Stomatal Lineage Cell Development by Single-CellRNA Sequencing. Mol Plant 2020;
DOI: 10.1016/j.molp.2020.06.010
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