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又双叒跨领域,单细胞测序技术还会带来多少惊喜?


当下,单细胞测序是研究最火的技术手段之一,尤其是在肿瘤学、系统发育学、再生医学和精准医疗方向,市场上已有大量关于这方面的研究思路供大家选择,但对于非医学方向领域的老师来说(如畜牧方向、植物研究领域等),相关研究思路总结则比较少。

在此,小欧基于PubMed网站,以关键词【single cell RNA seq】、【scRNA seq】、【snRNA seq】、【single nuclei RNA seq】和几个常见的畜牧相关的物种关键词(非模式动物物种)进行搜索,并下载查阅,整理获得共计50篇相关文章,如下所示:(完整目录和相关文献集索取可以扫描文章最下方二维码,联系小欧索取,也可以直接与区域销售联系索取)

经过梳理总结得知,目前畜牧方向的单细胞研究主要集中于以下6个研究方向:
1.细胞图谱分析:个体、器官、组织(已做的物种有猪、绵羊、鸡、鹿茸、犬、猫、蛇、蜜蜂和蝇等)
2.生产性状相关研究领域I:胚胎/肌肉/性腺等器官发育、组织再生方向(已做的物种有猪、绵羊、鸡、鹿茸、蝾螈、蛇等)
3.生产性状相关研究领域II:品种差异、性别差异、发育差异(已做的物种有猪、鸡)
4.物种进化:多物种进化分析,针对特定组织部位或细胞类型
5.自然规律和动物习性分析:比如衰老机制、昼夜节律(已做的物种有果蝇、食蟹猴、蜜蜂和斑马鱼等)
6.与临床医学挂钩的机理研究:疾病模型研究致病机制、抗病毒感染和药物干预、免疫微环境等(已做的物种有蜜蜂、采采蝇等)








 
下面,我们结合几篇文献案例给大家详细讲解一下单细胞测序技术在畜牧领域相关的研究套路:

案例1:scRNA-seq分析绵羊睾丸细胞图谱
论文题目Characterization of sheep spermatogenesis through single-cell RNA sequencing
影响因子:4.996
DOI10.1096/fj.202001035RRR 
研究目的:通过scRNA-seq获得睾丸细胞图谱,揭示精子发生和生精细胞发育中生殖细胞和体细胞之间复杂互作关系
样本纳入湖羊,睾丸(1cm3),n=1
研究内容
  1. 细胞图谱分析:对1只湖羊睾丸样本做scRNA-seq,得到有效细胞数目11,772个(测序数据量~200Gb),平均每个细胞检出2127个基因。利用人蛋白图谱数据集比对,共得到8种细胞类型,包含3种体细胞(白细胞、支持细胞和睾丸间质细胞)和5种雄性生殖细胞(早期初级精母细胞、晚期初级精母细胞、圆形精子细胞、细长精子细胞、精子)

  2. 细胞类型功能分析:基于GO和KEGG分析,结果表明支持细胞marker基因主要参与核糖体及核糖体绑定功能;早期生殖细胞主要参与RNA剪接和核糖核蛋白复合物、细胞周期等;晚期生殖细胞主要参与纤毛和基因加工;细长精子细胞和精子主要参与有性生殖、精子细胞发育、精子细胞分化、精子发生和雄性配子以及微管的运动和能量代谢过程;

  3. 精子生成轨迹分析:对5种生殖细胞拟时序分析,重塑了由早期生殖细胞到精子的发育路径,并对精子生成相关基因EZH2、SOX18、SYCP2和PCNA在生殖细胞中的表达做了免疫组化验证。

结论:重塑了睾丸精子生成轨迹,为家畜雄性生殖生理提供了基础信息。


案例2:scRNA-seq和蛋白组分析猪品种间骨骼肌发育差异
论文题目Association Analysis of Single-Cell RNA Sequencing and Proteomics Reveals a Vital Role of Ca2+ Signaling in the Determination of Skeletal Muscle Development Potential
影响因子:4.366
DOI10.3390/cells9041045
研究目的肌肉祖细胞可以分化为肌肉细胞和非肌肉细胞(如脂肪细胞),骨骼肌的正常功能与肌肉生成和异位脂质沉积抑制有关,本文主要分析了不同品系猪的肌肉发育过程中成肌和成脂细胞的动态平衡变化,探究其骨骼肌发育差异
样本纳入莱芜猪(L-肥胖型),约克夏猪(Y-瘦肉型),n=3
研究内容
  1. 体外功能研究:体外分离2个品种的Adi(成脂细胞)和Myo(成肌细胞),分别在诱导和不诱导的条件下分析其成脂和成肌功能,结果发现约克夏猪(Y)成肌功能较高,但脂肪生成抑制不明显;

  2. 体内机制分析I,scRNA-seq:选择2个品系猪的背最长肌,每个品种设置3个重复进行scRNA-seq。L型和Y型分别获得3661个和4257个细胞,平均每个细胞分别检测1166个和1312个基因,共得到6种细胞类型(成纤维细胞、肌源细胞、PDGFRβ+细胞、造血细胞、星形胶质细胞、内皮细胞)。组间差异分析发现,Y型相对于L型含有较高的成肌细胞占比(66.8%/52.7%)以及较低的成纤维细胞占比(33.12%/42.97%)。通过细胞亚群分析得到5个成肌细胞亚群,其中Y型主要为cluster 1,L型则为cluster2-5。结合拟时序分析和功能分析表明,瘦肉Y型的成肌细胞主要为肌源祖细胞类型,肥胖L型则主要为其他分化成熟的细胞类型(如卫星干细胞、卫星细胞、成肌细胞或者肌肉细胞),即较高比例的肌源细胞和较强的成肌分化能力是Y型成肌功能更强的主要原因。

  3. 体内机制研究II,蛋白组:为进一步探讨肌源细胞在品种间的差异,作者通过流式细胞术分选出Y型和L型的肌源细胞,进行TMT-6标检测。结果共检测6199个蛋白,其中差异蛋白(DEPs)181个,功能分析发现这些DEPs主要参与肌肉发育和再生,细胞增殖、分化和脂质形成抑制及离子转运等;

  4. 功能验证:最后作者选择了与离子稳态相关的6个DEPs做qPCR和蛋白验证,并结合实验表明胞内低浓度Ca2+有利于肌原细胞保持强大的分化能力。

结论:肌源细胞的较高比例和较强分化能力是瘦型猪成肌分化能力较高和肌内脂肪沉积较低的主要原因;瘦型猪肌系细胞内相对低浓度Ca2+有利于肌细胞系细胞保持较强的分化潜力。


案例3:scRNA-seq分析胚胎期性腺的性别分化和发育机制
论文题目:Insights into Gonadal Sex Differentiation Provided by Single-Cell Transcriptomics in the Chicken Embryo
影响因子:8.109
DOI10.1016/j.celrep.2020.03.055 
研究目的分析不同性别的鸡性腺发育机制共同点和不同点,及其与模式物种小鼠相比性腺发育的差异
样本纳入鸡胚性腺发育的4个阶段,即性别分化前(E4.5)、中(E6.5)、后(E8.5和E10.5)雌性和雄性左侧性腺;n=1(3个pool为1个)
研究内容
    1.细胞图谱分析:共得到23个cluster,22个细胞类型(内皮细胞、体腔上皮细胞、间质细胞群、支持细胞、孕核酮体细胞/前颗粒细胞、卵泡膜细胞前体、卵泡膜-颗粒细胞中间细胞、卵巢皮层、生殖细胞、红细胞、足细胞/肾小球、低线粒体表达细胞)。分别分析不同时期、不同性别共有和特有的细胞类型或cluster,随后利用marker基因验证不同细胞类型在雌性和雄性鸡胚性腺的空间分布,表明雄性和雌性相同细胞类型的marker表达差异和分布差异;
    2.性腺支持细胞谱系追踪
     3.卵巢发育起源分析
对雌性特有细胞群c7(前颗粒细胞)、c9(‘卵泡膜-颗粒’中间细胞)和c13(卵泡膜细胞)做拟时序分析,并结合免疫荧光和免疫组化实验,结果表明鸡胚胎在卵巢发育时,间质细胞群失去PAX2表达,但保留雌性特有OSR1H和WNT4基因,分化为FOXL2/CYP19A1+前颗粒细胞及卵泡膜细胞;
    4.睾丸发育起源分析
对雄性特有细胞群c5和c7(支持细胞)、c9和c13(支持细胞I)、c15(支持细胞II)、c3(低线粒体簇)做拟时序分析,结合免疫荧光和免疫组化实验,结果表明鸡胚胎在睾丸发育时,间质细胞群PAX2, OSR1和WNT4都被下调,雄性特有基因DMRT1上调,形成睾丸间充质细胞和2种不同的支持细胞亚群。
结论:本文详细描述了鸡性腺(卵巢和睾丸)的细胞发育谱系,并分析鸡同其他脊椎动物性腺在性别分化的差异。

以上3个案例分别选择了畜牧中常见的3个物种(绵羊、猪和鸡)的3个不同研究方向给大家做了简单分析,那最后我们针对单细胞测序在畜牧中研究现状进行小结(见下图所示)。
 
当然,这些只是一些中规中矩的操作流程,具体实验应该如何设计、样本如何选择、细胞解离方案及后续分析方案涉及等,老师可添加下方单细胞测序交流QQ群、关注公众号或者联系销售工程师,进行进一步沟通。
 
 
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参考文献
[1] Yang Hua,Ma Jianyu,Wan Zhen et al. Characterization of sheep spermatogenesis through single-cell RNA sequencing.[J] .FASEB J, 2021, 35: e21187.
[2] Qiu Kai,Xu Doudou,Wang Liqi et al. Association Analysis of Single-Cell RNA Sequencing and Proteomics Reveals a Vital Role of Ca Signaling in the Determination of Skeletal Muscle Development Potential.[J] .Cells, 2020, 9: undefined.
[3] Estermann Martin Andres,Williams Sarah,Hirst Claire Elizabeth et al. Insights into Gonadal Sex Differentiation Provided by Single-Cell Transcriptomics in the Chicken Embryo.[J] .Cell Rep, 2020, 31: 107491.

 
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