尽管在过去的几十年里，DNA测序成本大幅降低，但研究人员仍然面临着从三个方面考虑测序事宜：1）基因组覆盖度，即被测到的碱基占全基因组大小的比率；2）每个样本的测序深度，即每个碱基被测到的次数；3）测序的样本总数。

简化基因组测序（RAD-seq）的出现使得全基因组变异模式检测取得了突破进展，但是基因组大部分标记未获得是简化基因组的重要限制因素之一。

混池测序（Pool-seq）对于群体研究来说能够有效降低成本，但是，混池测序丢失了个体信息，无法进行个体层面的分析，也无法检测个体之间隐藏的信息。

有没有一种方案既能在群体水平对整个基因组进行研究，又能同时保留个体信息，而且其费用和RAD-seq、Pool-seq相当呢？

低深度重测序（lcWGS）正成为一种有效的替代方案，它借助概率统计策略，通过牺牲测序深度，以换取更大的基因组覆盖度和更大的样本量。那么低深度重测序可以分析什么类型的数据呢？什么样的实验设计可以获得最可靠的结果呢？今天带来低深度重测序群体研究之新手入门指南，希望能给大家带来帮助。

低深度重测序入门指南于2021年7月发表在Molecular Ecology，共包括四部分，详述如下。

对于基因组较小的物种来说，低深度重测序可能比简化基因组（RAD-seq）方法更便宜，而且随着测序成本的继续下降，价格可能会进一步下降。另外，对非模式生物来说，低深度重测序的限制条件是参考基因组。如果没有参考基因组，常规的解决方案是选择近缘物种。三代测序技术的发展，使得可以较低的成本获得染色体水平的基因组。因此，如果没有参考基因组，基因组de novo对启动新的低深度重测序研究可能是有意义的。

表1 低深度重测序建库和测序总成本

低深度重测序的主要挑战是不能准确地推断个体基因型。因此，近年来发展了许多相关的分析工具，涵盖了绝大多数常见的群体类型。目前，低深度重测序分析中最广泛使用的软件是ANGSD，这是一个全面的软件包，包含了各种分析选项。当然，对于大多数类型的分析，都可以使用各种各样的替代软件。

lcWGS流程图。上图：lcWGS预处理流程，和NGS流程非常类似。下图：lcWGS数据分析流程，它是使用基因型可能性来解释基因型不确定性的概率框架。从等位基因频率谱（site frequency spectrum，SFS）到多样性统计和FST，是ANGSD软件的分析流程。其他工具(如ATLAS)可以直接从GLs推断这些统计数据，而无需事先使用SFS。

没有一套单一的低深度重测序实验设计适合所有研究目的。相反，最优设计取决于研究的目标、系统和预算。在给定预算的情况下，低深度重测序主要权衡的是样本数量和测序深度。例如等位基因频率估计、群体结构分析、群体间的遗传分化等，可以通过更多样本的测序来获得准确的结果；等位基因频率谱（SFS）、使用δaδi进行人口统计推断、Tajima’D或LD绝对值，需要考虑更高的测序深度。因此，研究人员必须仔细考虑哪种类型的分析对研究目标是最重要的，并找到适当的平衡。综合我们的和以前的研究结果，我们提供了一些低深度重测序实验设计的一般指导原则。如果要优化特定的实验设计，也可以采用已建好的模拟流程（https://github.com/therkildsen-lab/lcwgs-simulation）。

表2 采用低深度重测序进行不同类型群体分析的实验设计建议

尽管低深度重测序有许多优点，但这种数据类型在群体研究方面也有明显的局限性。

1） 不适合需要调用基因型的分析；

2） 缺乏用户友好的软件界面和文档；

3） 计算成本高；

4） 工具箱存在缺陷，如基因型判读模型的灵敏度、比对错误等；

5） 当不同数据库整合时，易受批次效应影响；

6） 在没有参考面板时不能准确分相，因此不能进行基于单倍型的分析；

7） 不适合小样本量或基因组非常大的场景。

RN Lou, A Jacobs, A Wilder, et al. A beginner’s guide to low-coverage whole genome sequencing for population genomics. 2021,  Molecular Ecology, DOI：10.22541/au.160689616.68843086/v4

低深度重测序将给定数量的测序数据量分散到更多的样本中，虽然每个样本深度降低，但是仍然可以提高大多数群体类型推断的准确性。虽然低深度重测序还存在一些限制，但这种方法比简化基因组和混池测序提供了许多优势，可以广泛应用。另外，低深度重测序的多功能分析工具箱正在迅速扩大，这使得它成为分子生态学、保护和进化生物学研究的一个越来越有前景的方法。