2021 年 1 月，山东大学齐鲁医院泌尿外科李岩老师发表了小鼠膀胱尿路上皮细胞图谱和上皮亚群分化特征的相关成果，文章的 10x Genomics 单细胞转录组测序实验和分析工作由欧易生物提供。
该研究对小鼠的膀胱上皮进行了高通量单细胞转录组测序，绘制了小鼠膀胱尿路上皮细胞图谱，发现了一种可能与宿主反应和伤口愈合有关的新型 Plxna4+ 膀胱尿路上皮细胞，以及一群由 ASPM 标记的基底样细胞，可能是膀胱尿路上皮祖细胞。通过 SCENIC 分析确定了调控尿路上皮细胞分化的关键转录因子，发现了膀胱疾病相关调控基因在不同尿路上皮细胞亚群中存在差异表达。该研究全面解析了小鼠膀胱尿路上皮细胞的特征，为膀胱尿路上皮和膀胱疾病的相关研究提供生物学基础。
文章标题：Single-cell transcriptomes of mouse bladder urothelium uncover novel cell type markers and urothelial differentiation characteristics
期刊：Cell Proliferation
影响因子：5.753
研究材料：小鼠膀胱尿路上皮
研究方法：10x Genomics 单细胞转录组测序
膀胱尿路上皮是一种分层上皮，是血液和尿液之间的重要屏障，正常的膀胱尿路上皮对维持膀胱内环境稳定至关重要。许多膀胱疾病，特别是膀胱癌、膀胱疼痛综合征/间质性膀胱炎（BPS/IC）和细菌性膀胱炎等的发生与膀胱尿路上皮生物学功能密切相关。因此，研究膀胱尿路上皮的细胞类型、分子标志物及其参与的信号通路将有助于解析膀胱尿路上皮细胞与膀胱疾病之间的关系。
以往通过细胞培养、酶消化、手术分离等技术来研究膀胱尿路上皮，这种传统的方法无法获得膀胱尿路上皮的细胞类型特征和功能。本研究通过单细胞 RNA 测序，全面描绘了小鼠膀胱尿路上皮细胞图谱，并对上皮细胞亚型特征进行深入分析，为研究膀胱尿路上皮细胞类型、特定细胞标记物、信号分子等提供资源。
作者取小鼠的膀胱尿路上皮进行单细胞转录组测序，质控后共获得 18917 个高质量细胞进入下游分析。将上述质控后的细胞进行降维聚类分析可分为 8 个细胞群（图1C）。
作者通过分析每个 cluster 的特异性标记基因来对这些 cluster 进行细胞类型注释，主要可以分为表层细胞、过渡态、基底细胞三大类。
根据已知 marker 基因的表达，将 cluster 0 注释为基底细胞（B1）（图1D）；
cluster 1 既表达表层细胞的 marker（Upk1a, Upk3b），也表达基底细胞的 marker（Krt5），认为 cluster 1 为表层细胞与基底细胞之间的过渡细胞，因此将 cluster 1 定义为 BTS（BTS, basal to superficial cells）；
cluster 2 仅表达表层细胞的 marker，不表达基底细胞 marker（Krt20, Krt5），注释为 intermediate cell；
cluster 3，4 均为表层细胞，但又可根据其各自特征 marker 基因的表达分别定义为表层细胞 1（S1）和表层细胞 2（S2）（图2A, 2B）；
cluster 5 和 cluster 6 被鉴定为基底细胞（marker基因：Krt5, Itgb4, Trp63, Shh）（图1C），其中 cluster 5 的标记基因主要富集到 DNA 解旋酶相关功能，cluster 6 表达的基因主要为细胞周期调节基因以及 TCA 循环调节相关基因（图2C, D），暗示 cluster 6 的细胞代谢功能更为活跃（图2E）；
由于大部分已知的表层细胞与上皮细胞的 marker 在 cluster 7 中都不表达（图1D），使用 cluster 7 特异的标记基因将其命名为 Plxna4+ 尿路上皮细胞。
通过拟时序分析探究上皮细胞的发育轨迹（图3A, B）。通常认为基底细胞可以分裂产生表层细胞，如下图拟时序结果中 cluster 6 处于分裂起始点，其次是 cluster 5 与 cluster 0， BTS 细胞位于中间位置，暗示其处于过渡状态。表层细胞（cluster 3，4）和 Plxna4+ 尿路上皮细胞分别位于两个分化终点的位置，表明 cluster 6 可能扮演祖细胞的角色，Plxna4+ 尿路上皮细胞可能是一种特殊的表层细胞。随后通过 RNA velocity 分析揭示了膀胱尿路上皮细胞的发育谱系（图3D），结果表明， B3 细胞（cluster 6）、B2细胞（cluster 5）与 B1 细胞（cluster 0）之间存在一定的谱系关系， BTS （cluster 1）和中间细胞（cluster 2）参与了 S1 和 S2 的发育（cluster 3 和cluster 4）。
Cluster 7 由于特异表达 Plxna4+ 被定义为 Plxna4+ 膀胱尿路上皮细胞（图4A），该cluster表达表层细胞的 marker Upk3b, 不表达基底细胞的marker，推测可能为一种特殊的表层细胞。通过免疫荧光染色发现该群 cluster 7 位于膀胱尿路上皮最外层（图4B），与上述推论相符，同时对大鼠和人的膀胱尿路上皮进行免疫荧光染色也得出类似的结果（图4C, D）。
根据基底细胞的 marker 基因判断 cluster 5 和 cluster 6 为基底细胞，其中 cluster 6 由于特异表达基因 ASPM 而被单独命名为 ASPM+ 尿路上皮细胞（图5A）。全基因组分析表明 ASPM 可能是干细胞或祖细胞的标记物，结合拟时序分析的结果，cluster 6 分布在分化起始点的位置，表明 cluster 6 可能是一群具有祖细胞特性的细胞。作者通过对健康及 UPEC 损伤后的小鼠膀胱尿路上皮进行免疫荧光染色来探究这群细胞是否参与上皮的损伤修复过程，结果在健康小鼠尿路上皮中仅发现少量 ASPM+ 细胞，而 UPEC 损伤后，ASPM+ 细胞数量显著增加（图5B）。
通过 SCENIC 分析来识别不同膀胱尿路上皮细胞亚群中关键的转录因子，如图 6A 展示了每个cluster top 3的特异调控子。对调控子进行 CSI 模块分析发现，模块 M2 包含 12 个调控因子，其中 Foxa1、Grhl3、Foxq1、Grhl1、Htatip2、Ikzf2、Irf8 和 Creb3l2 被认为在细胞分化中发挥重要作用（图7）。
图7. CSI 模块分析
最后，为了探究哪些上皮亚型与 IC/BPS 疾病关系最为密切，作者通过热图展示了IC/BPS相关基因在各 cluster 中的表达情况，结果发现IC/BPS 疾病相关基因在基底样细胞亚群（B1、B2、B3）和 BTS 亚群中表达量较高，即这些亚群显示出与疾病更高的关联性。
文章总结
作者取了小鼠膀胱尿路上皮进行单细胞转录组测序，描绘出小鼠尿路膀胱上皮的细胞图谱并对上皮细胞的各个亚型特征进行了深入分析。
首先，根据文献中已知上皮亚型 marker 基因的表达进行细胞类型注释。针对一些使用文献marker 无法定义的细胞群，作者通过该群细胞特异表达的基因对细胞进行人为注释，鉴定出一群新型细胞即 Plxna4+ 尿路上皮细胞，通过免疫荧光染色发现该群细胞位于膀胱尿路上皮最外层。随后，通过拟时序分析模拟了上皮亚型间的转变轨迹，发现位于分化起始位置的一群细胞具有祖细胞特性，可能在上皮损伤再生过程中发挥作用。最后，通过 SCENIC 分析探究了各上皮亚群中的关键转录因子以及通过 IC/BPS 疾病相关基因的表达情况推断基底层样细胞和 BTS 细胞与 IC/BPS 疾病关系密切。
参考文献
Yan Li, Yaxiao Liu, Zhengdong Gao, et al. Single-cell transcriptomes of mouse bladder urothelium uncover novel cell type markers and urothelial differentiation characteristics. Cell Prolif. 2021 Feb 3;e13007. doi: 10.1111/cpr.13007.
