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项目文章 | Plant Journal:扬州大学陈忱教授团队发现 OsNF-YB9 调控水稻籽粒发育机制

2021 年 3 月,扬州大学陈忱教授为通讯作者,在 The Plant Journal 杂志(IF: 6.141)在线发表了题为“The rice LEC1-like transcription factor OsNF-YB9 interacts with SPK, an endosperm specific sucrose synthase protein kinase, and functions in seed development”的研究论文,报道了 OsNF-YB9 在调控水稻种子发育中的作用机制。

 

扬州大学牛百晓讲师、已毕业硕士研究生张真雨为共同第一作者,文章中酵母文库实验欧易生物完成。
 


研 究 背 景

 

NF-Y 转录因子家族成员 LEC1 在拟南芥胚胎发生和种子发育中发挥了重要作用。水稻中的 OsNF-YB9 和 OsNF-YB7 是拟南芥 LEC1 的同源基因。这些 LEC1 同源基因在水稻中的作用尚未经报道。

 



研 究 内 容

 

本研究报道了 OsNF-YB9 和 OsNF-YB7 在水稻中呈现亚功能化。OsNF-YB7 主要在胚中表达,而 OsNF-YB9 主要在发育中的胚乳中表达。在拟南芥 lec1-1 中异源表达 OsNF-YB9  OsNF-YB7 可以弥补 lec1-1 缺陷。OsNF-YB9 功能缺失导致种子发育异常,种子变长、变窄、变薄,垩白率较高。此外,osnf-yb9 中淀粉合成相关基因的表达紊乱。OsNF-YB9 可以与主要在水稻胚乳中表达的蔗糖合酶蛋白激酶 SPK 相互作用。spk 敲除突变体种子与 osnf-yb9 突变体种子都表现出垩白增加的表型。OsNF-YB9 在水稻和拟南芥中的异位表达导致了种子变小。综上表明,OsNF-YB9 在水稻种子发育中起到关键调控作用。



 

研 究 结 果

 

1. OsNF-YB9 和 OsNF-YB7 呈现不同的表达模式


在水稻不同组织部位中的 RT-PCR 显示,OsNF-YB9 主要在发育中的颖果中特异性表达,5 DAF 达到峰值;OsNF-YB7 在胚、颖果和愈伤组织中均有表达,5 DAF 的胚和颖果中均达到峰值(图 a)。原位杂交结果显示,OsNF-YB7 主要在胚的盾片中表达,OsNF-YB9 在 5 DAF 的胚乳中高表达(图 b)。GUS 报告基因分析也表明,OsNF-YB7 主要在盾片中表达(图 c)。不同的表达模式暗示 OsNF-YB7 和 OsNF-YB9 之间呈现亚功能化。

 

在拟南芥 lec1-1 突变体中异源表达 OsNF-YB7 或 OsNF-YB9,都可以回复由 lec1-1 突变所诱发的表型缺陷,揭示了单子叶和双子叶植物中 LEC1 样基因功能具有同源性。
 

图片说明:OsNF-YB7 和 OsNF-YB9 的表达分析


 


2. OsNF-YB7 和 OsNF-YB9 敲除导致水稻种子发育异常


为了研究 OsNF-YB7 和 OsNF-YB9 的功能,利用 CRISPR/Cas9 构建突变体水稻,结果显示无法获得 osnf-yb7 纯合突变体,且 osnf-yb7 杂合突变体产生的 osnf-yb7 纯合种子无法萌发,表明 OsNF-YB7 的缺陷可导致水稻种子致死。

 

在 osnf-yb9 突变体中,颖果中 OsNF-YB9 表达显著降低,OsNF-YB7 表达水平与野生型相当,表明 OsNF-YB7 和 OsNF-YB9 之间没有表达代偿作用。

 

osnf-yb9 突变体种子发育异常,表现为种子粒长增加、粒宽降低、颖片长度增加(图 b-d),扫描电镜观察显示细胞大小与野生型无差别,推测粒长增加主要是由于细胞数量增加所导致的。同时osnf-yb9 突变体种子垩白面积增加,垩白率提高(图 e-f),表观直链淀粉含量和总淀粉含量显著降低。RT-PCR 显示,osnf-yb9 突变体中淀粉合成相关基因表达显著改变,表明 OsNF-YB9 参与了水稻种子中淀粉生物合成的调控。
 

图片说明:OsNF-YB9 敲除影响粒形并增加种子垩白



 

3. OsNF-YB9 与 SPK 互作


为了研究 OsNF-YB9 调控种子发育的机制,以 OsNF-YB9 为诱饵,进行了酵母双杂交文库的筛选,结果显示钙依赖的种子特异性蛋白激酶 SPK 可以与 OsNF-YB9 相互作用,分段截取互作验证显示 OsNF-YB9 的 N 端是互作所必须的(图 a-b),并通过双荧光分子互补实验、BiFC、体外 GST-pulldown 实验得以证实(图 c-e)。

 

亚细胞定位显示 SPK 主要在细胞质中表达,OsNF-YB9 在细胞质和细胞核中都有表达,共表达 SPK 和 OsNF-YB9 显著促进了 OsNF-YB9 的入核(图 f),表明 SPK 和 OsNF-YB9 的相互作用可能促进了 OsNF-YB9 从细胞质向细胞核的运输。
 

图片说明:OsNF-YB9 和 SPK 的相互作用


 


4. SPK 敲除导致籽粒垩白增加


RT-PCR 显示 SPK 在发育中的种子中高表达,在 5 DAF 开始激活,并在 10-30 DAF 维持高表达水平(图 a-b)。spk 敲除突变体种子中垩白率的增加(图 c-e),但粒形和粒重与野生型没有显著差别。
 

 图片说明:SPK 缺陷导致种子垩白增加


 


5. OsNF-YB9 异源表达抑制生长和种子发育


与野生型对照相比,OsNF-YB9 过表达植株表现出植株矮小、分蘖更少、种子育性降低、籽粒变小(图 b-f),花粉活力显著降低(图 c),千粒重也显著降低(图 f)。

 

同时在拟南芥中异源表达 OsNF-YB9 和 OsNF-YB7,均导致发育缺陷、种子变小,表型与LEC1 过表达植株相似。
 

图片说明:OsNF-YB9 异源表达抑制水稻生长和种子发育


 


研 究 结 论

 

本研究对拟南芥 LEC1 基因在水稻中的同源基因 OsNF-YB7 和 OsNF-YB9 的作用进行了深入研究。结果显示,与 LEC1 类似,OsNF-YB7 和 OsNF-YB9 对于种子发育同样具有调控作用:OsNF-YB7 缺陷导致水稻种子致死,OsNF-YB9 缺陷导致种子异常。进一步的机制研究显示,OsNF-YB9 可以与 SPK 互作,敲除 SPK 同样可以引起与 osnf-yb9 突变体类似的缺陷表型。而在拟南芥和水稻中,过表达 OsNF-YB9 会导致种子发育缺陷、籽粒变小。


 


参 考 文 献

Niu B, Zhang Z, Zhang J, et al. The rice LEC1‐like transcription factor OsNF‐YB9 interacts with SPK, an endosperm specific sucrose synthase protein kinase, and functions in seed development. Plant J 2021; doi: 10.1111/tpj.15230.

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