虽然黑色素瘤是由起始黑色素细胞的点突变和有限的局部拷贝数变异引起的，但其致命转移性疾病特征遗传变异的本质尚不清楚。本研究通过13名患者不同部位和不同时间的黑色素瘤样本，通过WES和WGS测序及数据分析，解析了人类黑色素瘤从早期发展到晚期的进化突变特征。对88个肿瘤样本的全外显子组和基因组测序数据显示，只有有限的获得性点突变以及一些转移瘤中存在缺失突变。相比之下，黑色素瘤的进化主要由全基因组加倍和大规模非整倍体主导，在这些非整倍体中，广泛的杂合性缺失（LOH）甚至在从未接受治疗的患者和一些患者的原发性皮肤黑色素瘤中导致了点突变、新抗原和结构变异。这些结果表明，基因组完整性的失调是黑色素瘤进展过程中选择性克隆优势的关键驱动因素。
发表期刊：Nature Communications
影响因子：12.121
发表时间：2021年3月
研究背景
皮肤黑色素细胞的恶性转化通常是由紫外线光诱导的DNA损伤导致的单核苷酸变异（SNVs）引起的。已有研究表明癌症进展过程中持续获得SNV和SVs。在未经治疗的黑色素瘤患者以及在产生治疗耐药性的患者中观察到一系列的基因变化，包括新的SNV和局部等位基因的扩增和缺失，这表明黑色素瘤的进展是由突变推动的，而不是由传统的紫外线诱变引起的。该研究描述了与晚期黑色素瘤相关的体细胞突变过程。
测序策略
1. 样本准备：来源于13个患者的88例肿瘤样本（肿瘤组织或FFPE样本）
2. 全外显子捕获测序（WES）：Agilent SureSelect Human All Exon V5 or V6捕获体系，测序深度100-200×
3. 全基因组测序（WGS）：测序深度为30×（对照样本）或60×（肿瘤样本）
研究结果
1. 样本采集和测序
DNA样本采集自7例级联黑色素瘤患者的正常组织、配对原发性黑色素瘤或局部转移肿瘤组织用于基因组测序。从黑色素瘤确诊到死亡的存活时间从8个月到12年不等。所有级联患者都有BRAF突变型黑色素瘤，并在病程中接受了BRAF或MEK抑制剂，一些患者还接受了免疫治疗。利用对7例患者肿瘤组织或正常血浆组织进行全外显子组测序（WES，平均深度156×）或全基因组测序（WGS，平均深度67×），另外将已发表的6名患者的配对原发性和转移性肿瘤WES数据也用于该研究分析中。因此，共获得13位患者（11例为原发性黑色素瘤，2例为局部转移）的88例肿瘤样本的WES或WGS数据。
2. 黑色素瘤进展过程中体细胞SNVs和InDels的变化
为了解黑色素瘤进化中的突变过程，研究者评估了每个患者早期和晚期肿瘤的突变特征。早期突变可预测为紫外信号（信号7a和7b）主导（图1A）。相反，在晚期肿瘤中首次观察到的突变大多具有非紫外线信号，在至少3例患者中，信号31、38、39和58都非常明显。虽然38号特征的病因尚不清楚，但它只在UV相关的黑色素瘤中发现。在8例晚期疾病患者中也出现了UV标记突变，这可能来自于早期肿瘤的低丰度亚群的远端转移。对获得的早期肿瘤突变数据分析，发现在黑色素瘤中循环突变的基因或COSMIC数据库中一些最常见的基因被影响（图1B）。绝大多数早期肿瘤的SNV出现在所有转移部位。
图1：突变过程和候选驱动基因的时间选择表明，紫外线损伤和DNA修复功能障碍在不同的时间阶段占主导地位。A. 早期和晚期疾病的突变特征。B. 在早期或晚期疾病中反复突变的黑色素瘤或COSMIC癌症基因。C. 高频突变分布情况。
3. 等位基因不平衡的获得性和杂合性缺失
为更好地识别突变缺失背后的过程，研究者重点关注等位基因拷贝数变异（CNV）。包括LOH在内的等位基因不平衡（AI）在所有患者的所有患病部位都很明显，通常涉及整条染色体或染色体臂。在所有患者中，黑色素瘤进化的特征是AI在早期疾病中的亚克隆性增加（如患者CAS-D、ETH-J中的多个原发核） 或在转移性样本中分亚群（如CAS-C、ETH-F中的病变）。在一些患者（CAS-D、ETH-E和SK-H）中，约50%的晚期肿瘤基因组受到LOH的影响。SNV/InDel的缺失或丢失在早期到晚期肿瘤中都有发生，晚期肿瘤中SNV/InDel大量缺失的重要原因是LOH（图2A）。
在每个患者中，等位基因特异性拷贝数改变（CNAs）通常涉及相同的等位基因，表明这些克隆具有共同的起源。然而，与肺癌的观察结果类似，不同的转移组织中偶尔会有不同的等位基因参与。在两例CAS-G患者的肝转移中，15号染色体通过影响不同等位基因的独立缺失事件导致LOH。同样，在CAS-B患者中，10号染色体通过局部和内脏转移中不同等位基因的缺失导致LOH （图2B）。
越来越多研究认为如基因融合之类的结构变异（SVs）是黑色素瘤的致癌驱动因素，我们也通过分析患者CAS-D的WGS数据，检查了LOH对SVs的影响。发现在左侧肝转移灶的2号和4号染色体上观察到的几个SVs在肝脏病变组织中不存在，并伴有LOH。同样，肝脏病变10号染色体上LOH的延伸与SVs的丢失相一致（图2D）。因此，LOH不仅可以造成SNP和InDels，也可以形成SVs。虽然单个LOH事件的选择性亚克隆优势难以预测，但这些观察结果突出了SVs造成癌症基因组广泛突变的可能性。
图2：转移性黑色素瘤中广泛的等位基因失衡（AI）和杂合性缺失（LOH）。A. 左: 受等位基因不平衡影响的每个组织样本的基因组比例。中:在细胞遗传学水平上每个样本的等位基因不平衡。右:显示所有同时发生LOH的缺失突变的比例。B. 在CAS-B患者的局部和远处转移中SNP的等位基因频率。C. LOH事件对新抗原突变的影响。D. LOH事件对结构变量（SVs）的影响。
4. 晚期黑色素瘤的特征是染色体倍性增高
对拷贝数变异（CNVs）的分析表明，与LOH和AI的观察结果一致，晚期肿瘤的CNVs通常是大规模的，而且一般可以在ctDNA中检测到。早期病例中主要为二倍体（平均2倍），而晚期肿瘤样本中染色体倍性平均为2.9倍，并且染色体倍性的增加通常在肿瘤向远端转移发展时观察到。分析结果表明，7号染色体上的BRAF、RAC1、MET，1q染色体上的AKT3和8q染色体上的MYC等基因在这些区域的表达增加具有明显的选择性优势（图3A）。未治疗过的黑色素瘤中存在较大的CNVs，表明这种变异的发生可以与治疗无关。通过荧光原位杂交（FISH）对6例患者的预测倍性变化进行验证（图3B），在CAS-B患者中证实了脑和肺转移肿瘤组织中拷贝数的增加（图3C）。倍性增加主要是由于发生WGD事件或者染色体或染色体臂水平的拷贝数变异（图3D）。
图3：转移性黑色素瘤中普遍存在超倍体。A. 受拷贝数改变（CNAs）影响的每个组织样本的基因组比例。B. 用荧光原位杂交（FISH）在6例患者中验证CN。与原发肿瘤（左图）相比，C. FISH显示来自CAS-B患者的两个转移瘤中MYC扩增。D. 广泛存在的黑色素瘤基因组加倍。
5. 调节基因组完整性的基因突变
由于晚期黑色素瘤的高水平CNAs，研究者还考察了调控基因组完整性、细胞周期和DNA修复的基因突变情况。与非整倍体耐受性相关的有害TP53突变在4例患者的肿瘤早期获得，另外2例在肿瘤晚期获得。CLTC（有丝分裂纺锤体不稳定性）、APC（检查点缺陷）和BUB1B（检查点缺陷）等参与调控基因组完整性的基因也不断受到有害突变的影响 （图4A）。
对于存在于四倍体但不存在于二倍体样本中的SNV或四倍化后相对增加的SNV，研究者也进行了进一步的评估（图4B）。
图4：早期和转移性黑色素瘤非整倍体和全基因组倍增的潜在驱动基因。A. 基因群中的反复突变调节染色体结构完整性、细胞周期和DNA修复。B. 突变的突变等位基因片段（MAF）随着倍性的增加而增加或增加等位基因剂量，与基因组倍增有关。
6. 肿瘤进化分析
已发现在黑色素瘤进化中有显著的CNVs，研究者以等位基因特异的CNV为基础构建了4个肿瘤患者的空间上独立的肿瘤和晚期疾病ctDNA的系统进化树，这4例患者经历了从早期的近二倍体到晚期的超倍体过程。研究者还基于SNV以及SNV和拷贝数估算了系统发育树，为这些病例的肿瘤进化研究提供了见解。虽然几乎所有远处转移瘤的基因组倍增现象普遍存在，但有的患者（CAS-G、CAS-D和CAS-B）基因组倍增后仍继续获得非整倍体。另外，不同患者中发生基因组倍增的时间也各自不同，有的发生在亚克隆阶段，有的在原发肿瘤中，还有的仅在远端转移中观察到，这说明基因组加倍并不是允许远处转移的绝对必要条件，而且在基因组加倍之前和之后都可以发生CNVs（图5A）。
该研究还证实，在黑色素瘤发展过程中，多数患者晚期疾病中SNVs的负担大多是在早期疾病中获得的，在疾病发展过程中没有显著变化。相反，获得CNV的动力学变化显著，所有患者在早期疾病中至少有低水平的非整倍体，并且高度复发9号和10号染色体全部或部分丢失。该研究的每一例肿瘤患者中都发生了WGD事件。几乎在每一次远端转移中，LOH的范围都增加了，表明携带这些事件的细胞具有共同的克隆来源。这些结果表明通过删除事件而产生的基因组塑形在黑色素瘤中具有生物学优势（图5B）。
图5：黑色素瘤的进化。A. 基于拷贝数构建的4位患者肿瘤发生的系统进化树。B. 从黑色素瘤早期发展到晚期的基因变化。
研究结论
该研究通过对黑色素瘤早期和中晚期患者样本进行WES和WGS测序和数据分析，发现基因组四倍体化和非整倍体的获得是贯穿进化到终末期致命黑色素瘤的主要突变机制，其形成不一定是抗癌治疗或转移过程给予癌细胞的应激结果，也不需要转移和治疗的耐药性。基因组紊乱似乎在黑色素瘤的肿瘤内进化中普遍存在，赋予其亚克隆的竞争优势。该研究还提出WGD或其增强的耐受性对持续获得等位基因不平衡的可能性，或许对黑色素瘤有预后意义。通过ctDNA检测可以观察到转移性黑色素瘤中四倍体化和非整倍体显性模式，可能是一种有用的、微创的、对单个黑色素瘤患者疾病演化关键阶段的重要预后监测手段。
参考文献
Vergara IA, Mintoff CP, Sandhu S et al. Evolution of late-stage metastatic melanoma is dominated by aneuploidy and whole genome doubling. Nat Commun. 2021 Mar 4;12(1):1434