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空间转录组,只做1个透化够吗?

空间转录组是在组织原位检测基因表达的一种技术,与bulk RNA-seq或单细胞转录组测序相比,空间转录组避免了组织中细胞位置信息的丢失,使得我们在检测基因表达的同时获得基因在组织内部的空间位置信息。

 

在过去的几年中,空间转录组学备受各界关注。2020年,Nature Methods更是将空间转录组学评选为年度技术。可以预见,在未来的5-10年里,空间转录组学妥妥的是技术热点。2019年,10x Genomics公司推出Visium空间基因表达解决方案,其技术一经问世,便备受瞩目。

 

10x Visium 技术原理为将新鲜冷冻的组织切片,置于文库制备载玻片上,经过固定、染色和透化后,释放出mRNA,mRNA与空间条形码捕获探针相结合,从而捕获基因表达信息。然后将捕获的mRNA合成cDNA并制备测序文库进行测序,并对数据进行可视化分析。
 

 空间转录组技术原理

 

从技术原理中不难看出,空间转录组技术核心为特殊的载玻片。10x 提供的载玻片分为两种:用于摸索组织最佳透化时间的组织优化玻片和用于正式实验的基因表达玻片。
 

 左侧为基因表达玻片,右侧为组织优化玻片




 

组织优化玻片的作用是什么
 

组织优化(TO, Tissue Optimization)玻片用于摸索某个组织类型的最佳透化时间。组织优化玻片上的oligo没有spatial barcode,也不会构建测序文库,当合成一链cDNA的时候,在反应体系中加入带有荧光基团的核苷酸,这样合成出来的cDNA就带有荧光。通过荧光强度可以反映出组织中mRNA释放量的多少,从而确定某个组织类型最佳的透化时间。通常情况下,选择荧光信号最强、RNA扩散最少、内部组织结构最清晰的时间点作为最佳透化时间点。如果发现荧光信号发生扩散,说明透化时间过长。在确定最佳透化时间之后,就可以使用最佳透化时间开始空间基因表达的正式实验。




 

组织最佳透化时间摸索方法


组织优化玻片包含8个捕获区域(大小 8 mm x 8 mm),每个捕获区覆盖有用于捕获基因的寡核苷酸,其中6个区域可以设置6个不同的透化时间,另外2个区域分别为阴性对照和阳性对照——阴性对照放有组织切片但不加透化剂,阳性对照不放组织切片,直接加入 RNA。10x官方建议透化摸索时间从3min到30min,设置时间梯度。

组织优化玻片



 


组织最佳透化时间选择示例


组织透化具体实验流程为:组织贴片→固定→染色→扫描仪明场成像→组织透化→荧光 cDNA 合成→组织移除→荧光扫描。根据荧光强度判断最优的透化时间,荧光越亮,透化效果越好。

 

下图为小鼠脑组织的透化预实验玻片荧光扫描结果,阴性对照显示无荧光信号,而阳性对照显示强信号。透化3-12分钟后信号强度较低,提示透化不充分;而透化18分钟后的荧光信号强度最高,因此选择18分钟为最佳透化时间。

 小鼠脑组织透化预实验荧光扫描玻片




 

如何设置组织优化实验


最佳透化时间会受到几个关键因素的影响,包括物种、组织类型、病理状态、样本制备方法、切片厚度、实验室条件等等。组织类型的改变会影响最佳透化时间,一般情况下,10x Genomics建议当处理一种新的组织类型时,应该进行一次组织透化预实验。在保持组织类型一致的情况下,可以只进行一次组织优化实验,确定的最佳透化时间可用于处理多个Visium基因表达玻片。

 

10x官方的标准说明为,“A TO experiment should be performed when processing a new tissue type”,而“new tissue type”的定义如下图所示。
 

组织类型的分类

 

由于样本组织来源个体可能不同,组织大小、切片位置等有所差别,同一种组织类型的不同样本间也可能存在最佳透化时间不一致的情况。如果样本的最优透化时间可能存在不同,而我们实验时仅选取一个样本进行最佳透化时间摸索,则可能导致其他样本出现透化不充分或透化时间过长的现象,造成后续数据质量可能不高的风险。

 

不过在项目执行过程中,1张TO玻片的费用也要近2万,是一笔不小的开支。如何才能既降低空间项目执行过程中的风险,又避免过多的费用开销呢?

 

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