近日，上海交通大学/复旦-交大-诺丁汉植物生物技术研发中心主任唐克轩课题组在New Phytologist（IF：8.512）发表了题为“AaWRKY9 contributes to light- and jasmonate-mediated to regulate the biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua”的研究论文，揭示了青蒿转录因子AaWRKY9有助于光和茉莉酸信号所介导的青蒿素生物合成调控的新型分子机制，文章中酵母双杂交文库由欧易生物协助完成。

疟疾是人类最古老的疾病之一，每年4月25日是世界防治疟疾日，疟疾目前仍是公众健康所面临的最严重威胁之一。基于青蒿素的联合处理法（ACTs）是WHO推荐的最佳处理方案。因发现具有抗疟作用的青蒿素，挽救了数百万人的生命，屠呦呦教授获得了2015年诺贝尔生理或医学奖，从青蒿中分离出的青蒿素被推荐作为抗疟疾的首选药物。之前研究表明，茉莉酸（JA）介导促成的青蒿素积累依赖于光，转录因子HY5也通过参与光信号调控促进青蒿素合成。然而，光与JA相互作用机制及其对青蒿素生物合成调控的潜在机理仍未得到解决。

本研究通过蓝/红光诱导青蒿中青蒿素生物合成基因的表达，使用转录组分析确定了一个WRKY转录因子AaWRKY9，可明显激活青蒿素生物合成相关基因的表达。实验表明AaWRKY9通过光依赖JA信号通路调节，在青蒿素生物合成中发挥重要作用，AaWRKY9通过与AaDBR2和AaGSW1的启动子结合正向调节青蒿素的积累。此外，JA信号通路中的抑制因子AaJAZ9与AaWRKY9相互作用，并抑制其转录激活活性，而在MeJA存在情况下，AaJAZ9被降解，AaWRKY9的转录激活活性增加，进而促进青蒿素生物合成基因的表达。结果表明，AaWRKY9有助于光和JA信号调节青蒿素的生物合成，为两种信号途径在植物次生代谢物合成中的整合调控提供了新见解。

1. 蓝光和红光诱导青蒿素生物合成基因的表达

将光照下栽培2周的青蒿幼苗转移到黑暗条件下生长24小时后，进行qRT-PCR检测，结果表明青蒿素合成相关基因表达显著降低。且相比在白光和红外光下，在红光和蓝光下生长的幼苗青蒿素及青蒿素酸含量更高。表明蓝光和红光在青蒿素的生物合成中起着关键作用。对红光、蓝光处理后的青蒿幼苗进行转录组测序分析，发现了4个转录因子表达量同时受红光、蓝光诱导。双荧光素酶检测发现AaWRKY9（AA213240） 可以结合青蒿素合成相关基因启动子并显著激活其表达。酵母单杂、EMSA进一步检测证明AaWRKY9可以结合AaDBR2/AaGSW1的启动子中的W-box5/4片段，并激活其转录表达。

图1 Dual-LUC检测转录因子对启动子的激活效应

(a) AaADS, (b) AaCYP71AV1, (c) AaDBR2, (d) AaALDH1

图2 AaWRKY9结合AaDBR2和AaGSW1启动子检测

(a)(d)标注AaDBR2和AaGSW1启动子上的W-box结合位点；(b)(e)酵母单杂检测结果；(c)(f)EMSA检测结果

2. AaWRKY9的表达可同时响应光信号和JA信号，促进青蒿素合成

对比黑暗及蓝红光处理后AaWRKY9的表达量变化趋势，显示AaWRKY9的表达受光照诱导。而先前的研究表明，植物激素MeJA处理可以提高青蒿素的产量。qRT-PCR分析显示，MeJA处理可以显著诱导AaWRKY9的表达。功能验证实验显示，AaWRKY9过表达可增加青蒿素含量，敲除表达青蒿素含量降低。说明AaWRKY9是正向调控青蒿素生物合成的转录因子。

3. AaHY5增强AaWRKY9的转录

HY5在介导光控制的基因表达中起重要作用，黑暗下，AaHY5 可以与AaCOP1互作，并经26S蛋白酶体途径降解。光照下，COP1表达量下降，HY5得以积累。本研究发现，光照下/AaHY5过表达株系中，AaWRKY9表达显著增强；黑暗条件下/AaHY5 RNAi株系中，AaWRKY9表达显著降低。EMSA检测显示AaHY5直接结合AaWRKY9启动子中的G-box（CACGTT)元件，激活其表达。

4. AaJAZ9与AaWRKY9互作，并抑制其转录激活作用

通过酵母双杂筛选实验，进一步研究AaWRKY9蛋白功能，结果筛选到了与AaWRKY9互作的AaJAZ9蛋白，并通过Y2H、BiFC、CoIP等进行了验证确认。

图3 AaWRKY9与AaJAZ9蛋白间存在互作

(a)Y2H验证结果；(b)BiFC检测结果

JAZs是JA介导的植物相应中的负向调控因子，在毛状体和老叶中高表达，在芽尖和嫩叶中表达量低。为确认AaJAZ9是否抑制了AaWRKY9在促进青蒿素积累过程中的转录激活功能，通过双荧光素酶报告基因检测实验发现，当AaWRKY9与AaJAZ9共表达时，其转录活性被抑制，而使用MeJA处理后，这种抑制作用被抵消，且AaWRKY9转录活性增强，反向验证实验结果一致。说明JA可以通过降解JAZ9，提高AaWRKY9转录活性，促进青蒿素生物合成。

图4 AaJAZ9蛋白抑制AaWRKY9的转录活性

(a)-(d)使用烟草叶片，检测MeJA存在与否情况下，AaJAZ9与AaWRKY9共表达后青蒿素合成相关基因的启动子活性

本研究揭示AaWRKY9通过参与光和JA信号通路调节青蒿素生物合成，为光与JA信号调节植物次生代谢提供了新的分子机制。黑暗条件下，AaHY5被泛素E3连接酶AaCOP1降解，导致AaWRKY9转录水平下降，且缺少JA，导致AaJAZ9与AaWRKY9互作，青蒿素合成相关基因AaDBR2和AaGSW1不能被启动表达。补充JA条件下，虽然JAZ9被降解，但是由于AaHY5被降解，AaWRKY9仍被抑制转录。光照条件下，AaHY5促进AaWRKY9转录，且JAZ9经JA信号途径被降解，导致AaWRKY9启动青蒿素合成相关基因转录，促进青蒿素合成积累。

图5  AaWRKY9促进光和JA信号调控青蒿素合成的工作模型

注：原文结果图片在本文中仅部分展示。

X Fu, Peng B , Hassani D , et al. AaWRKY9 contributes to light‐ and jasmonate‐mediated to regulate the biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua[J]. New Phytologist.