慢性粒细胞白血病（CML）患者急变期（BC）预示不良结局。尽管附加的基因改变在BC中起着核心作用，这些改变的特征和预后影响仍然很难确定。本研究利用外显子组和靶向测序技术，全面研究了来自216例CML患者的136个急变期（BC）和148个慢性期（CP）样本的遗传异常。136例BC患者中有126例（92.6%）存在一个或多个基因异常，包括RUNX1-ETS2融合和NBEAL2突变。在从CP到BC的转变过程中，基因改变的数量增加明显受到酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的抑制。BC的谱系和TKIs的使用与不同的分子谱相关。值得注意的是，基因改变而不是临床变量有助于更好地预测BC预后。总之，基因异常有助于预测CML的临床结果，并指导临床决策。

发表期刊：Nature Communications

影响因子：12.121

发表时间：2021.05

CML是由Ph标记染色体产生的BCR-ABL1基因融合引起的骨髓增生性疾病。最近，随着靶向BCR-ABL1融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的发展，CML的预后显著改善。然而，少数慢性期（CP）患者对TKI治疗无效，进展为急变期（BC），临床结果不佳。虽然已知BCR-ABL1激酶结构域的突变是TKI抗性的主要决定因素之一，并有发生突变的风险，但进一步的基因改变被认为是发展到BC的必要条件。事实上，最近的研究已经证明了在胚转化过程中获得了几个驱动基因突变。然而，目前对TKI耐药的遗传基础以及CML-CP向BC发展的了解仍受限于每个研究中分析的患者和/或基因数量较少，以及缺乏匹配的CP和BC样本。

另一个值得关注的问题是，BC患者的5年总生存率从2000-2004年的16%提高到2010-2016年的33%，这可能与TKIs的使用增加有关。TKIs可能对某些BC患者有效，有助于提高生存率；然而，大多数BC患者对TKIs不再有反应。如果确实如此，预测哪些BC患者对TKI有反应对于更好地管理CML具有相当重要的临床意义。不幸的是，目前已知只有少数临床因素或生物标志物与基于TKI方案治疗的BC患者的临床结果相关。

在本研究中，研究者调查了一大批CML患者，以揭示CP和BC期间CML的遗传病变。该研究的目的是识别与TKI耐药和母细胞转化相关的基因改变，以及那些预测临床结果的基因改变。为此，对CP和BC样本（包括配对的CP和BC样本）的基因改变进行了无偏测序分析。

1. CML的克隆进化

首先，研究者对52例CML患者配对的CP和BC样本进行了全外显子组测序 （WES），以确定与CML-BC克隆进化相关的基因改变，平均测序深度为157x（图1a）。在从CP向BC发展期间（0.7-155.1个月，中位数为26.7个月），平均发生5.3个（或0.088/Mb）非同义单核苷酸变异（SNVs）（图1 b）。值得注意的是，泊松回归模型显示，CP向BC发展期间获得的突变数量与间隔时间独立正相关，而与CP诊断后的TKI治疗负相关（图1b）。这些结果提示，在没有有效治疗的情况下，CP向BC的转化与体细胞突变随时间的积累有关，而这种积累被TKI治疗显著抑制，这可能会阻止CP向BC的转化。

在CML-BC样本中，髓系恶性肿瘤的驱动基因经常发生突变，包括RUNX1、ABL1、ASXL1、bor /BCORL1、TP53和WT1（图1c）。在最近报道的BC基因中研究者还发现了反复突变，如UBE2A13、14和SETD1B13，另外还发现了之前未报道的基因的突变，如KLC2和NBEAL2。对这些配对CP和BC样本进行高深度扩增子测序（平均深度2589x），显示ASXL1突变已经出现在CP样本,而包括RUNX1、ABL1, TP53在内的其他主要的驱动基因的突变在CP样本中没有，而是出现在向BC发展的过程中（图1d）。在少数患者中，其他基因的突变，如WT1和IDH2，也在相应的CP样本中发现，根据变异等位基因频率（VAFs）计算，肿瘤细胞分数（TCFs）低于BC样本。这些结果表明不同的突变在CML的进展中有不同的作用。通常情况下，至少有一个伴随突变具有与ASXL1突变相当的TCFs，并且可能存在于BC样本的主要克隆中。因此，在克隆向BC发展的过程中，ASXL1突变的CP克隆可能被优先选择并通过获得其他驱动因子而进化。
 

图1：CML克隆进化过程中获得的体细胞突变。a.一个展示研究队列的方案。数字表示分析样本。CP和BC圆圈重叠区域的数字表示CP和BC的分析病例数。W全外显子组测序，T靶向捕获测序。b.使用配对的CP和BC样本，对52例经WES治疗的CP到BC的进展时间（横轴）和获得的SNVs数量（纵轴）进行散点图分析。也绘制了95%置信区间的回归线。诊断为CP后采用或不采用TKI治疗的病例单独指征。c.52例CP向BC进化过程中获得的突变频率。描述了复发性获得或已知的驱动基因。突变的类别用不同的颜色表示，“多重”表示在同一患者的同一基因中发现的≥2个不同的突变。d.通过深扩增子测序，确定相应CP和BC样本中提示突变的TCFs。

对拷贝数改变（CNAs）进行分析，发现CNVs在急变期（BC）中常见，而在慢性期（CP）中很少出现（图2a），表明在CP向BC的发展过程中也获得了CNAs。研究者还基于一种算法，利用了包含断点连接的reads和不正确对齐的reads，分析了基因捕获区域附近的结构变异（SVs）。虽然分析流程是基于断点位置和基因捕获区域检测SVs，但这种检测方法也识别了一个倒位事件，导致一个髓性急变期患者中RUNX1-ETS2基因融合，并利用RT-PCR和Sanger测序验证了该基因融合 （图2b）。多时间点的qPCR结果显示，在确诊为慢性期时，这种融合就已经存在，并且CML-BC化疗成功后，这种融合的负担与BCR-ABL1的负担相关（图2c）。因此，RUNX1-ETS2可能在CML-CP向BC的快速发展中起重要作用。
 

图2：CML-CP和BC中的CNAs和RUNX1-ETS2融合。a. 52例CML-CP和BC样本中拷贝数分析。b. 一例患者中通过WES分析检测到RUNX1-ETS2融合。c. qRT-PCR评估一例患者中几个时间点RUNX1-ETS2和BCR-ABL1负荷的动态变化时间图。

2. CML-BC 的遗传景观

研究者对104个骨髓肿瘤相关基因（包括利用WES在另外60例BC样本和19例CP样本中发现的候选驱动基因）进行靶向捕获测序，平均测序深度585×。结合52例配对的BC和CP样本的WES数据以及24例BC和77例CP患者的外部WES数据，综合分析了136例BC和148例CP病例中的SNVs、CNAs和SVs （图1a）。总体而言，136例CML-BC患者中有126例存在至少一种突变或CNA（图3）。大多数突变（89.7%）涉及表观遗传调控和信号传递的基因，如染色质修饰、DNA甲基化、转录因子、内聚复合体和信号通路。除了KLC2和NBEAL2，还发现了另一个反复发生的突变靶点（PHIP）在两名患者中发生了突变。基于本研究测序的拷贝数分析显示，26.5%的BC患者中存在复杂的CNAs（≥3个异常CNAs）。

研究者进一步探讨了基因异常与BC家系之间的关系（图3）。某些病变,如+21, +8, +19以及ASXL1和TP53突变，在髓系急变中富集，而另外一些突变，包括CDKN2A/B和IKZF1 缺失、-7/del（7p）、-9/del（9p）则在淋巴系急变中富集。相比之下，观察到的RUNX1突变和+Ph等异常在两种急变中几乎相同。对遗传病变之间的两两相关性分析显示，根据病变的组合，存在共现模式。研究结果表明，尽管在遗传性病变中观察到大量的重叠，髓系和淋巴系BC病例在谱系归属和分子特性方面是不同的。

研究者随后比较了既往有和无TKI治疗史的BC患者的基因改变，以探讨既往TKI治疗史是否影响BC患者的基因谱。与预期一致，ABL1代表最常见的突变，在接受TKI治疗的患者中几乎都发现了，而ABL1突变都是伴随着其他基因的改变,如RUNX1 （7/20）、ASXL1（5/20）和BCORL1（5/20）突变等，与已有报道一致。此外，与未接受TKI治疗的患者相比，有TKI治疗史的BC患者更有可能携带-7/del（7p）、-9/del（9p）和复杂CNAs，而接受TKI治疗的患者中BCOR、TP53和RUNX1突变的频率较低。这表明，尽管non-ABL1突变是否会影响TKI反应/耐药性尚不清楚，但TKI治疗和未治疗的CML-BC患者的基因谱是不同。

图3：CML中髓性和淋巴性BC的遗传景观。 a. 129名BC患者的突变频率。b. 瀑布图展示136名患者遗传突变总体情况。

3. CML-BC基因异常的预后相关性

研究者分析了99例有生存信息的CML-BC患者的遗传异常的预后相关性以及临床特征。在OS临床特征的单因素分析中，BC的TKI治疗和母细胞谱系与OS显著相关，而其他参数，包括年龄、性别、血细胞计数和BC之前的TKI史，没有显著相关（图4和5a），对>5%患者的遗传病变进行单因素分析，发现ASXL1突变、del（17p）、i（17q）、+19、+21、超二倍体和复杂的CNAs。值得注意的是，同时伴有TP53突变和del（17p）的患者结果非常不好（图4）。与之前的一份报告一致，该报告显示多次TP53突变与骨髓增生异常综合征的复杂核型和不良预后相关。四分之三的CML-BC患者双等位TP53突变显示了复杂核型的存在。因此，基因异常可能是预测BC患者临床结局的良好生物标志物。

图4：CML-BC中遗传异常的预后相关性。99例CML-BC患者根据临床或遗传因素确定的OS Kaplan-Meier生存曲线。采用log-rank检验计算各因素对OS的预后影响。

研究者对生存期进行了分析，重点关注59例TKI治疗的患者，因为基于TKI的治疗已被证明可以显著改善OS，因此是目前CML-BC1患者的治疗选择。在单因素分析中，WBC计数、母细胞谱系、ASXL1和bcc突变、复杂CNAs、del（17p）、i（17q）、+19和+21与OS显著相关。研究者利用Cox比例风险回归模型评估基因改变的相对影响，该模型采用标准的临床和遗传变量的逆向选择，并确定ASXL1突变、复杂CNAs、i（17q）和+21作为较差预后的独立预测因子（图5b）。为了内部验证这一发现，通过bootstrap进行了100次建模，最终模型的所有四个变量都以>70%的频率被选择，平均一致性统计量为0.74。根据这些不利因素的数量，将TKI治疗的BC患者分为预后明显的3个亚组，其中有0个、1个和≥2个不利遗传危险因素的患者的2年OS率分别为65.0%、17.1%和0% （图5c）。该研究结果表明，遗传风险因素或许有助于确定可能对TKI难以治疗的患者。

图5：CML-BC中各临床或遗传因素对预后的影响。a. 总结99例BC患者的个体临床或遗传因素与BC谱系、既往TKI史和OS的关系。b. Cox比例风险回归模型与逐步变量选择识别独立危险因素，预测59例接受tki治疗的BC患者的OS。c. 根据b中列出的遗传因子数量统计59例TKI治疗的BC患者OS存活曲线。

4. CML-CP的遗传景观和临床结果

最后，研究者探讨了基因异常对CML-CP患者临床结局的影响。因为本研究有意纳入配对的CP和BC样本，以研究CML克隆进化的分子发病机制，因此，与其他队列相比，该队列包含更多最终发展为BC的患者（48%）(图1, 图6a）。总体而言，25.7%的CP患者在诊断时发现了其他的基因变异。与之前分析一致，在CP和BC中只有ASXL1突变频率接近，包括TET2、KMT2D、PTPN11、 RUNX1和WT1在内的其他基因在CP中仅有很低的突变频率（图6a）。研究者评估了ASXL1突变与患者年龄之间的相关性，与之前的报道一致，许多ASXL1突变的患者在诊断为CP时小于60岁，而年龄相关克隆造血功能的患者则相反。此外，年龄对CML-CP患者的ASXL1突变频率没有显著影响（图6c）。研究者还评估了CP的基因改变是否可以预测TKIs治疗患者的BC进展。有趣的是，与未接受TKI治疗的患者（15.8%）相比，接受TKI治疗后发展为BC的患者往往存在至少一个突变和/或CAN (38.5%，图6 d)。因此，即使很少被观察到，CP的基因改变在驱动CML细胞在TKI压力下转化为BC的过程中发挥了作用，这与以前的报道一致。

图6：CML-CP的遗传景观。a. 148例CP患者的遗传病变。b. 148例CP患者的突变频率。c. 根据ASXL1突变的是否存在突变，展示CP诊断的年龄。d. BC进展中存在任何遗传异常的患者比例。

本研究基于一项具有详细临床信息的大队列CML患者的全面遗传分析和纵向取样，展示了CML- CP/BC的遗传景观、克隆进化及其与临床特征和预后的相关性。本研究证明基因异常可以有效地作为预测BC患者预后的生物标志物，比临床参数更能预测生存情况。由于ABL1突变本身并不与CML-BC预后差相关，且几乎总是伴随着其他突变，因此针对其他突变联合TKIs可能是未来有前途的治疗策略。值得注意的是，对各种药物的敏感性与急性髓系白血病患者的突变相关，这增加了在不久的将来，治疗可能会根据个体突变进行个性化的可能性。

外显子组测序分析显示，随着时间的推移，CML细胞积累了体细胞突变，而基于TKI的治疗明显抑制了这种突变。尽管这一现象的确切原因尚不清楚，但有可能是TKIs的应用消除了快速循环的带有BCR-ABL1融合基因的细胞，而忽略了对体细胞突变影响较小的慢速循环细胞。TKI介导的母细胞转化减少可能是由于存在获得BC驱动突变风险的肿瘤细胞数量的急剧减少。然而，该研究结果表明，抑制随机突变事件可能有助于降低TKI治疗患者的BC风险。总之，该研究在一个大队列中证明了CML的不同突变谱和克隆进化，并将遗传异常与临床特征和结果关联起来，将有望为更好地管理CML患者带来有效的治疗和对策。

Ochi Y, Yoshida K, Huang YJ. Clonal evolution and clinical implications of genetic abnormalities in blastic transformation of chronic myeloid leukaemia. Nat Commun. 2021 May 14;12(1):2833.