植物从营养生长到生殖生长时相的不可逆转变，是植物生命周期中的一个关键阶段，是植物生存和繁殖至为关键的重要事件。在开始繁殖之前，许多多年生木本植物经历了一个相当漫长的幼年时期。与模式植物（如拟南芥）相比，针叶树通常具有非常长的生命周期。尽管在模式植物开花时间控制研究上取得相当大的进展，但对多年生树木，特别是针叶树年龄信号的调控机制仍知之甚少。因此，深入研究林木年龄信号对生殖发育过程的影响具有重要的理论和实践意义。
2021 年 5 月，北京林业大学钮世辉副教授为通讯作者，在 Plant Physiology 杂志（IF: 6.902）在线发表了题为“MADS-box transcription factors MADS11 and DAL1 interact to mediate the vegetative-to-reproductive transition in pine”的研究论文，深入探讨了油松中营养生长-生殖生长时相转变调控的分子机制。
北京林业大学马晶晶博士为第一作者，文章中酵母双杂交文库由欧易生物制备。
研究内容
本研究通过 7 个树龄的油松样品转录组测序，鉴定到一个与年龄信号显著相关的基因模块，该模块包含 33 个转录因子，包括 SOC1-like、DAL1 等。油松和晚坐果白皮松突变体中的基因表达模式分析显示，PtMADS11 与生殖能力之间存在紧密相关性。酵母双杂交显示，MADS11 和 DAL1 直接相关作用以参与对年龄信号的调控。过表达 PtMADS11、PDAL1 可以部分挽救拟南芥中 miR156 过表达或 spl 突变导致的开花延迟缺陷。只有 PtMADS11 可以挽救 ft 突变体中的开花缺陷，表明它与 PtDAL1 在拟南芥开花调控网络中发挥了不同的作用。
研究结果
1. 一个与松树年龄信号显著相关的基因模块
为研究松树生长时相转变和生殖发育的奥秘，本研究收集了油松 7 个年龄段的叶片进行了转录组测序。加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定到一个与年龄显著相关的基因模块（图 A）。按照表达模式，可以分为 2 个子模块：随年龄增长而表达上升的基因子模块、随年龄增长而表达降低的基因子模块（图 B-D）。这些基因在 5-7 年营养生长至生殖生长过渡期发生了一个明显的表达模式转变，表明在生殖发育启动阶段存在一个相对剧烈的时相转变过程。
图 1 | 7 个不同年龄阶段差异表达基因的 WGCNA 和表达模式分析
2. MADS 结构域转录因子 PtDAL1 和 SOC1-like 是油松年龄信号模块中的关键因子
在上述年龄相关的基因模块中包含 33 个转录因子，它们可以紧密形成一个共表达网络（图 A），其中 11 个转录因子属于 MADS-box 家族，包括之前在挪威云杉中发现的年龄时相转变调控因子 DAL1。另外还鉴定到 6 个 SOC1-like 基因，并且这些基因均表现出年龄依赖的表达模式（图 B）。
进一步在多个树龄、多个组织中验证上述转录因子的表达模式，结果显示，SOC1-like 和 PtDAL1 基因并非生殖发育特异的，也同样在营养器官中积累。
图 2 | 油松不同年龄差异表达基因中富集到 MADS-box 转录因子
3. MADS11 是针叶树繁殖能力调控的潜在因子
针叶树遗传转化困难，难以进行候选基因的功能验证。本研究鉴定到 1 个矮化、超晚坐果的白皮松突变体（图 A）。与正常对照相比，PbMADS11 在突变体中表达几乎检测不到（图 B），暗示它可能参与繁殖能力的调节。
一般来说，针叶树的成熟和繁殖能力被认为发生在沿着树干的顶端-基部梯度上。在油松顶端的嫩枝中 PtMADS11 高表达，并且向基部逐渐降低。这些结果都表明，PtMADS11 与生殖能力具有高度相关性。
图 3 | MADS11 是针叶树繁殖能力调控的潜在因子
4. MADS11 和 DAL1 相互作用调控年龄信号
为了进一步研究生长时相转变的分子机制，转录因子互作网络分析显示 PtMADS11 和 PtDAL1 与多个转录因子高度相关（图 A）。酵母双杂交实验表明，PtMADS11 与 PtDAL1 之间存在直接的相互作用（图 C），并通过 BiFC、GST pull-down 得以证实（图 D-E）。
图 4 | PtMADS11 与 PtDAL1 相互作用
5. MADS11 和 DAL1 在拟南芥中通过不同的机制诱导早期开花
为进一步研究在年龄信号调控中的作用机制，分别构建了过表达 PtDAL1 和 PtMADS11 的拟南芥。与对照相比，过表达 PtDAL1 显著提前了拟南芥的营养-生殖时相转换（图 A），证实 PtDAL1 在生殖起始和控制花器官建立起到了关键作用。过表达 PtMADS11 植株在短日照下表现出早开花和花序结构过早终止，表明 PtMADS11 在开花调节和花序内分生组织命运起到调控作用。
在拟南芥中利用年龄调控通路不同节点关键基因突变体进行功能互补实验，结果显示过表达 PtDAL1 可以恢复由于过表达 miR156 导致的开花延迟，但 ft 缺失会导致 PtDAL1 失活，PtDAL1 过表达也不能恢复 soc1-1-2 突变体的表型，表明 PtDAL1 依赖或处于 FT / SOC1 的上游。而过表达 PtMADS11 可以恢复由过表达 miR156 或 ft 缺失导致的开花延迟，表明 PtMADS11 对开花的调控不依赖于 miR156 或 FT。
以上结果表明，PtMADS11 和 PtDAL1 在开花调控网络中发挥了不同的作用。
图 5 | PtDAL1 和 PtMADS11 在拟南芥和松树中调控开花的作用
研究结论
本研究从年龄相关基因模块中鉴定出 33 个紧密联系的转录因子，它们呈现 2 中不同的表达模式，共同参与营养生长和生殖生长的平衡。其中 PtDAL1 作为时相转换的关键调控因子，通过与 PtMADS11 互作正向调控油松的生殖能力。并且在拟南芥中的功能互补实验表明 PtDAL1 和 PtMADS11 通过不同的机制参与对年龄信号的调控。
参考文献
Ma J, Chen X, Song Y, et al. MADS-box transcription factors MADS11 and DAL1 interact to mediate the vegetative-to-reproductive transition in pine. Plant Physiology 2021; doi: 10.1093/plphys/kiab250.
