6月 24 日，扬州大学园艺与植物保护学院贺振和刘芳教授作为共同通讯作者，在 Genome Biology 杂志(影响因子13.583) 发表了题为“The dynamics of N6-methyladenine RNA modification in interactions between rice and plant viruses”的研究论文，揭示了m6A修饰在植物和病毒相互作用中的重要性。扬州大学张坤博士为第一作者。文章中的m6A RNA甲基化测序（MeRIP-seq）及分析服务由欧易生物完成，值得一提的是，欧易销售工程师时松及生信研发工程师刘玲在测序和分析上的贡献还受到了客户的点名致谢~

N6-甲基腺嘌呤（m6A）RNA甲基化是原核生物和真核生物中最常见的RNA修饰之一，也是近年来的研究热点之一。m6A修饰被认为可以通过调节mRNA稳定性和翻译来影响其功能。在植物领域，目前大多数的研究都集中在m6A对发育、进化和生理的影响，关于m6A在植物和病原体相互作用中的确切功能，以及这些功能是否参与生理和病理改变，还没有太多的认识。

该研究通过MeRIP-seq技术获取了感染两种毁灭性病毒的水稻植株的高质量m6A甲基组数据，以及病毒基因组RNA的m6A图谱，并通过与转录组测序的联合分析发现在植物病毒侵染过程中，m6A的整体修饰水平被激活，并与不活跃表达的基因相关。此外，研究者通过LC-MS/MS和Dot plot技术检测了病毒感染后不同时间点的总体m6A水平的动态变化，并基于qRT-PCR和MeRIP-qRT-PCR的技术对与植物抗病毒通路、植物激素代谢通路及m6A关键基因进行了定量验证，通过整合分析揭示m6A修饰对植物基因表达的调控作用及其在植物和病毒相互作用中的重要性。

1、水稻幼苗中RSV和RBSDV的侵染

研究者首先构建了两种常见水稻病毒RSV和RBSDV侵染水稻植株的模型，感染RBSDV的水稻植株出现矮化、叶片变暗等生长异常现象，感染RSV的水稻植株表现出叶片变黄、条纹、萎黄和植株生长减慢（图1A）。从有症状的植株上采集叶片，通过qRT-PCR和WB验证病毒的感染（图1B-C）。随后，对模拟感染、RSV感染和RBSDV感染的水稻样品进行了进一步的MeRIP-seq检测和分析。

图1 RSV和RBSDV侵染水稻幼苗

2、RSV和RBSDV基因组RNA中的m6A甲基化

RSV和RBSDV分别为单链RNA病毒和双链RNA病毒，因此研究者在分析水稻m6A RNA甲基化的同时，还将测序reads与病毒基因组RNA序列进行了比对，并分析绘制了病毒全序列m6A peak图谱（图2A-B）。结果表明，RBSDV基因组RNA的m6A修饰多发生在基因组的5’端（图2A，C），而在RSV基因组上是随机分布的（图2B，D）。这可能是由于这两种完全不同的植物病毒的特性所致。这些结果也说明，在病毒与水稻的相互作用下，除寄主植物的mRNA外，病毒mRNAs也可能发生N6-甲基腺苷甲基化，并且m6A在病毒基因组RNA上的分布模式具有特异性。

图2 RBSDV和RSV基因组RNA中m6A甲基组图谱

3、病毒感染对水稻m6A RNA甲基化水平的激活作用

为了探讨感染病毒后，水稻m6A RNA甲基化水平的变化，研究者对水稻来源的测序数据进行了分析。结果显示，在RSV和RBSDV侵染下，水稻m6A RNA甲基化发生了丰富的变化。在病毒侵染样本中，m6A peak相较于模拟侵染组数量明显增多（图3A）。与模拟组相比，感染RBSDV和RSV的水稻植株分别有8,010和6,602个独有和差异的m6A peak（图3C）。总的来说，在植物病毒侵染下，水稻mRNA的m6A修饰水平得到了提高。

图3 病毒感染激活水稻m6A甲基化

4、m6A与感染病毒水稻植株中的非活跃表达基因有关

随后，研究者基于MeRIP-seq中的input样本数据（相当于转录组测序）进行了基因表达分析，并将m6A peak与基因表达量进行联合分析，结果显示，无论是模拟处理还是RSV和RBSDV感染的水稻样品，m6A甲基化都主要发生在低表达基因中，病毒侵染后m6A修饰基因的数量在低表达类别略有增加（图4）。

图4 植物病毒侵染下水稻m6A甲基化与基因表达水平的关系

5、差异m6A修饰基因的功能分析

对于差异m6A peak所处的基因区域分析显示，大多数差异m6A位点位于基因的非编码区（图5A）。针对差异m6A修饰基因进行GO和KEGG富集分析，结果显示m6A修饰广泛参与、并与感染RSV和RBSDV的水稻中的碳水化合物代谢、氨基酸代谢和蛋白质翻译/加工/降解密切相关（图5B-C）。

图5 水稻感染RBSDV和RSV后差异m6A甲基化基因的GO和KEGG分析

6、水稻m6A甲基化修饰对病毒侵染表现出敏感和动态的反应，与植物抗病毒RNA沉默途径和激素代谢途径的基因表达相关

为了探究m6A在病毒和植物互作过程中的作用，作者又通过LC-MS/MS和Dot plot技术检测了水稻中m6A修饰的整体水平，结果可以看到，病毒侵染后，m6A的整体水平随着时间的推移而显著升高（图6A-B）。随后，作者选择了两个关键基因（分别是来自抗病毒RNA沉默途径的OsAGO18和植物激素代谢途径的OsSLRL1）进行了后续的MeRIP-qPCR和qPCR验证，结果发现OsAGO18和OsSLRL1的相对表达量的变化与其m6A修饰水平的变化密切相关，不同基因区域的m6A甲基化可能对其表达产生不同的影响（图6C-F）。除此之外，作者也对抗病毒途径和激素代谢途径中的其他基因的表达量进行了验证，结合m6A peak的分布，可以看出m6A甲基化可能参与了主要的抗病毒RNA沉默途径和植物激素途径。在植物-病毒相互作用的拔河竞赛中，RNA甲基化可能作为一种精细的调节因子来调节靶基因的时空表达。

图6 植物病毒侵染下水稻m6A甲基化与基因表达水平的关系

7、m6A修饰参与病毒感染水稻中的m6A相关基因的表达调控

Writer，Reader，Eraser以及供给甲基的甲基合成酶（Donor）构成了m6A甲基化机制中的四大主要成员。研究者在病毒感染和对照样本中通过qRT-PCR技术检测了水稻中的4个Writer基因，5个Eraser基因，12个Reader基因和5个Donor基因的相对表达量（图7A-D），并与MeRIP-seq检测到的m6A修饰水平进行整合分析，发现m6A修饰发生在植物m6A甲基化相关基因中，并可能调控这些基因的表达（图E）。

图7 植物病毒侵染下水稻m6A相关基因的m6A修饰和基因表达整合分析

1） 揭示了水稻与病毒相互作用过程中m6A修饰的动态变化，这可能是基因表达的主要调控策略；

2） 强调了m6A修饰在植物和病毒相互作用中的重要意义，特别是在调节关键通路相关基因的表达方面。

Zhang K, Zhuang X, Dong Z, et al. The dynamics of N6-methyladenine RNA modification in interactions between rice and plant viruses. Genome Biol. 2021;22(1):189. Published 2021 Jun 24. doi:10.1186/s13059-021-02410-2

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