众所周知，酵母双杂交技术是研究蛋白相互作用的利器。目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交技术发现的。但是做过酵母杂交实验的小伙伴也都知道蛋白筛选较容易，但是筛选后，想知道获得的阳性克隆都对应的是啥基因，所花费的人力物力相当不小。有困难解决困难，勇敢牛牛不怕困难。小欧从2018年即开始关注酵母杂交与高通量测序相结合的技术发展，如2017年Cao Gang老师等发表的RLL-Y2H技术，实现了文库筛文库可能，该技术通过对酵母双杂常用载体的改造，并结合高通量测序，可直接获得AD-BD互作蛋白对。所用方法相当巧妙，感兴趣的同学请点击《当酵母双杂交遇到高通量测序》。
今天小欧又给大家带来了一篇酵母双杂交结合高通量测序技术的应用文章。北京林业大学钮世辉老师团队，在传统的酵母双杂交技术流程基础上，巧妙的结合了NGS技术，优化建立了Y2H-seq技术，大大缩短了常规的筛库后测序验证周期，节约了实验成本。文章中应用Y2H-seq技术，对不老松年龄密码进行了有趣的研究，其中所用酵母双杂交文库由欧易生物协助完成。
钮老师团队之前的研究已经鉴定了DAL1作为一种保守的针叶树年龄生物标记基因，在油松从营养生长到生殖生长的时相转变过程中起重要作用。《项目文章 | Plant Physiol：北京林业大学发现针叶树年龄信号的调控机制》。
为了进一步理解年龄效应如何驱动针叶树的发育，阐明与DAL1相关的蛋白互作网络很关键。钮老师团队利用传统的Y2H筛选技术结合NGS测序技术，优化得到了Y2H-seq技术，与传统的筛选测序相比，大幅度节省了时间和实验成本。通过该技术，本研究获得了DAL1相关的蛋白互作网络，并结合生信分析，构建了一种新的针叶树老化途径的调控模型，对针叶树年龄调控机制研究及优良针叶林木繁育技术研发提供了重要参考。其主要的实验路径如下（图1）↓↓
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通过传统的酵母双杂交系统，以PtDAL1为诱饵，筛选样本来源于不同年龄段的油松cDNA文库。
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将获得的阳性克隆，10个一组，挑选到1个96孔板的PCR板孔中，获得10*96个阳性克隆的96孔板。以其中阳性克隆mix为模板，进行PCR扩增，并将所有的PCR产物进行纯化。
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使用纯化后的PCR产物，进行打断后构建二代测序文库，通过NGS测序，获得6G的阳性克隆数据。
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通过分析二代测序数据，获得阳性克隆基因信息（去冗余后获得135个互作子，包含21个TFs，2个TRs及酶类、热激蛋白、RNA结合等蛋白，部分见表1）。
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挑选重要的候选基因进行一对一验证（图2）。
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与拟南芥中同源基因AGL6 的蛋白互作网络进行比对分析。
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对DAL1互作蛋白（DIPs）的基因表达谱、启动子中的顺势作用元件功能进行分析，并对DIPs进行GO注释（图3）。综合生信分析结果，构建针叶树老化途径的调控模型（图4）。
图1. Y2H-seq技术流程图
表1. PtDAL1 互作蛋白注释（部分）
图2. PtDAL1 互作蛋白 Y2H 验证
图3. PtDAL1 互作蛋白的GO功能分析
图4. PtDAL1介导的油松生长与发育调控预测模型
总结
本研究通过Y2H-seq技术鉴定了135个高可信度的油松PtDAL1直接相互作用蛋白，结合已有数据库及研究背景，构建了PtDAL1介导的油松不同年龄阶段的生长发育调控模型。对苗期生长缓慢的针叶树育种具有重要意义。
参考文献
Chen X, Zhu Q, Nie Y, et al. Determination of conifer age biomarker DAL1 interactome using Y2H-seq. Forestry Research 2021; doi:10.48130/FR-2021-0012.
Ma J, Chen X, Song Y, et al. MADS-box transcription factors MADS11 and DAL1 interact to mediate the vegetative-to-reproductive transition in pine. Plant Physiology 2021; doi: 10.1093/plphys/kiab250.