“优质”的单细胞悬液是决定单细胞测序结果的下限，也是单细胞测序高质量数据的唯一相关因素，听惯了“看得见”的碎片处理、细胞团过滤、死细胞去除。今天来就由小欧来带大家听听”看不见”的最危险。
单细胞悬液制备
目前认知下的制备单细胞悬液需要将组织置于37℃保温，以便蛋白酶发挥作用。其主要缺陷在于，细胞在37℃下具有较高的代谢活性，解离过程将不可避免的引发大量应激基因的高水平表达，造成细胞转录组的“人为误差”和测序结果失真，无法真实反应取材时细胞的“转录模式”，大大降低了结果的准确性和可靠性[1]。
通过使用具有低温解离活性的蛋白酶，已有文献报道对37℃解离引起的偏差进行了消除和减弱，取得了不错了效果，显著提升了测序数据质量。Adam等人通过使用具有低温活性的蛋白酶，对小鼠肾脏组织进行单细胞测序，结果证明了在6℃条件下进行解离，可以有效的消除、降低人为误差[2]。这是由于在6℃及以下的温度条件下，细胞的转录复合物（transcriptional machinery）失去活性，无法产生新的转录产物。O’Flanagan等人随后在肿瘤组织中进行相同的实验，结果表明低温解离能够有效的降低应激基因的表达，提高数据结果的准确性和可靠性[3]。Denisenko等人进一步比较了不同解离方法的差别，其中低温解离能有效抑制因为酶解带来的转录“偏好”（图1）[4]。
以上文献结果表明，采用低温解离方案能够有效的消除、降低由于37℃温育带来的“转录偏差”，提升数据质量，增强结果的准确性和可靠性。
小欧的实验案列
以小欧的动物组织低温解离实验为例，选取酶解位点遍布上皮、结缔、肌、神经组织的普适性最广泛的地衣芽孢杆菌酶作为工具，在辅因子的帮助下，在4℃~6℃对组织中原代细胞进行分离。下图为具体实施例：
心脏酶解实例(仅酶解)
肺酶解实力(仅酶解)
肾脏酶解实例(仅酶解)
如上展示，低温解离技术可以拿到数量、活率毫不逊色于常温酶解得到的原代细胞悬液。
经过10+例人/鼠样本测试，通过悬液优化：
1.筛网过滤 ：40μm细胞筛网除去细胞团块及碎片。
2.碎片去除：密度梯度离心去除细胞碎片，根据细胞与杂质比重差纯化细胞。
3.裂解红细胞：对含有大量红细胞的样本，使用红细胞裂解液进行红细胞裂解。
4.去除死细胞：磁珠法或流式细胞仪去除死细胞提高活细胞占比。
5.缓冲液清洗：DPBS或其它不含钙镁离子，EDTA的缓冲液清洗细胞2~5次。
均能得到与常规解离无异的单细胞悬液结果，下图为实施例展示。
心脏优化实例
肺优化实例 
肾脏优化实例
用低温解离方案能够复制出质量与常规解离的单细胞悬液制备无异的结果。不仅如此还能避免那些“看不见”的危险，提高数据质量下限，有效的避免由于37℃温育带来的“转录偏差”，提升数据质量，增强结果的准确性和可靠性，为后期个性化分析保驾护航。
写在最后
细胞是生命活动的基本功能单位。不同类型细胞之间的相互作用网络构成了生命的基础。研究对象的这一“基本属性”决定了单细胞高通量技术是目前我们解析各种生命现象、揭示各种生物学机制的最强有力的技术手段。随着单细胞测序技术的发展，原核细胞的scRNA-seq技术也将得到越来越多的应用。这一领域的进展必将为基础研究以及临床研究、乃至工程学应用带来全新的手段和方法，为我们攻克各种疾病提供新的技术，为人类健康与发展带来福祉。
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参考文献
[1]Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017 Sep 29;14(10):935-936.
[2]Psychrophilic Proteases Dramatically Reduce Single-Cell RNA-seq Artifacts: A Molecular Atlas of Kidney Development. Development. 2017 Oct 1;144(19):3625-3632.
[3]Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 2019 Oct 17;20(1):210.
[4]Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 2020 Jun 2;21(1):130.
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心志盒子 撰文
本文系欧易生物原创
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