植物原生质体解离过程中存在外界应激，会造成结果失真
目前，通过制备植物原生质体，利用单细胞技术来研究植物细胞之间异质性，已经被广泛认可并应用，植物原生质体的制备技术也较为稳定，但在原生质体制备过程中涉及机械离心，抽打混匀、解离温度等，这些因素给原生质体造成了诸多外界刺激，可能引起原生质体的转录组在解离过程中发生较大变化，从而造成“解离偏好”，使测序结果具有“假阳性”。
转录抑制剂能有效解决解离结果假阳性问题
那么如何来解决实验过程中由于人为因素导致的转录变化呢？提起转录组变化，首先我们想到的就是使用转录抑制剂，顾名思义，转录抑制剂可以通过特异性地与DNA链结合或改变RNA酶活性来抑制某些转录，现在市面上的转录抑制剂包括茴香霉素、雷公藤内酯、放线菌素、α-鹅膏覃碱、BMH-21等等，它们的作用原理如下：
目前已在动物组织单细胞测序中有所应用，那么能不能把转录抑制剂也应用于植物原生质体解离及测序中呢？虽然植物和动物都是生物组织，但在物种生理特性、理化特性上都有极大的差异，适用于动物细胞的方法并不一定能简单适用于植物原生质体。基于这种想法及想解决问题的决心，我们决定突破它！
成果初显：转录抑制剂的添加对植物原生质体解离效果未产生明显影响
我们以拟南芥叶片作为目标材料，对照组按照正常解离流程进行，实验组在解离过程中加入转录抑制剂。实验结果如下图所示，对照组（如图A）和实验组（如图B）解离出的原生质体均可达到单细胞测序要求，说明加入转录抑制剂对解离后原生质体的解离效果不会产生影响，可以进行后续处理分析。
图A：对照组拟南芥叶片原生质体分离镜检图。
图B：实验组拟南芥叶片原生质体分离镜检图。
转录抑制剂可有效抑制由外界刺激导致的原生质体的转录组变化
经单细胞测序及生信分析显示，对照组较实验组的应激基因表达有明显的升高，而代谢类的基因表达有明显的降低（表1），说明在解离原生质体的过程中添加转录抑制剂，可以抑制由外界刺激导致的原生质体的转录组变化。
图C：对照组拟南芥叶片原生质体单细胞测序细胞聚类图。
图D：实验组拟南芥叶片原生质体单细胞测序细胞聚类图。
表1：对照组VS实验组表达上调及下调的应激基因
差异基因分析也证明转录抑制剂的添加可以保证测序结果真实稳定
对两组进行差异基因分析发现对照组与实验组比较共鉴定出349个上调基因，表达差异较大的前25个基因均为与应激机制相关的应激基因，鉴定出422个下调基因，表达差异较大的前25个基因均为代谢相关基因，说明在解离过程中加入转录抑制剂进行植物原生质体分离，可以有效抑制在解离过程由于人为及外界环境因素所导致的细胞转录组变化，从而保证测序结果真实稳定。
图E：对照组与实验组差异基因的表达情况热图
从以上实验结果可知，在植物原生质体解离过程中添加转录抑制剂，能够高效地从拟南芥组织中解离得到原生质体，并达到单细胞测序各项指标，且操作简单，重复性高，实用性强，在后续的开发使用中具有极大的潜力。
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佳琦 撰文
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