论文题目：Species-Resolved Metagenomics of Kindergarten Microbiomes Reveal Microbial Admixture Within Sites and Potential Microbial Hazards
发表期刊：frontiers in Microbiology
发表时间：2022年3月
影响因子：5.640
作者单位：新加坡宝洁创新中心
文章中2bRAD-M微生物组检测技术服务由青岛欧易生物提供
研究背景
小孩子通常每天要在幼儿园呆8个小时，由于儿童密度高和儿童缺乏适当的卫生习惯，幼儿园可能暴露于大量不同种类的病原微生物，因此成为疾病传播的完美热点。事实上，儿童是最容易感染病原体的群体，与其他年龄组相比，他们的感染率、住院率和死亡率更高。
幼儿园常见微生物已有明确的记录。然而，过去的研究通常采用基于培养的方法，因此无法检测所有潜在的微生物。16S rRNA基因扩增子测序分辨率低，无法在种水平上准确地描述微生物。基于上述限制，宏基因组测序由于能够在种水平上全面、无偏地对微生物组进行分类，成为一种有吸引力的替代方法。但是，从建筑环境中收集的样本通常生物量较低，并且可能严重降解，因此在这些样本上应用宏基因组测序技术一直很难。为了应对这些挑战，我们最近建立了一种新的宏基因组测序方法，称为2bRAD-M，该方法在“种水平”对低生物量、降解或污染的微生物组进行分析时特别有利。
本研究采用2bRAD-M方法，以中国山东省青岛的2个幼儿园做为室内环境模型，分别从7个室内采样点和15名儿童洗手前的手掌采集样品，共计114份样本，从种水平分辨率上分析了表面微生物群落，并探讨了儿童—环境—微生物可能的相互作用。
研究结果
两所幼儿园及采样点的表面微生物菌群不同
来自7个采样点的99个室内表面样本，细菌占所有样本相对丰度的95%以上，真菌主要集中在游戏室灰尘和游戏室地板上，主要有子囊菌门和担子菌门。在种水平上，各个采样点的优势微生物是 （1号幼儿园 6.1%，2号幼儿园：6.7%），这与之前的报道相符合。但是，从微生物群落结构来看，两所幼儿园存在显著差异（图1A），而且种水平的alpha多样性差异也支持这一结果，即两所幼儿园在厕所地板( = 0.016)和玩具表面( = 0.015)上的Shannon多样性指数存在显著差异。
除了幼儿园间的差异外，还分析了各幼儿园内的微生物剖面。结果发现，在这两所幼儿园中，从地面（游戏室灰尘、厕所地板和游戏室地板）收集的样本形成一个独特的簇，与从那些手触摸的物体（书包、玩具表面、图画书和彩色铅笔）收集的样本不同，表明这两种表面之间的微生物群落是截然不同的（图1B,C）。
图1 | 基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)方法对幼儿园种水平上的微生物组成进行可视化分析。（A）两所幼儿园的PCoA结果显示两所幼儿园的微生物种类组成存在显著差异(PERMANOVA; R = 0.059, < 0.001)。此外，对1号幼儿园（B）和2号幼儿园（C）分别进行了个体PCoA研究，发现来自于地面（游戏室灰尘、游戏室地板、厕所地板）的微生物种类组成和来自手触摸物体（绘本、书包、玩具表面、彩色铅笔）的微生物种类组成存在显著差异（1号幼儿园: PERMANOVA; R = 0.467, < 0.001, 2号幼儿园: PERMANOVA; R = 0.366, < 0.001）。每个点对应一个样本，并根据幼儿园或采样点着色。椭圆对应95%置信区域。
取样表面之间的微生物的交叉传播
手是儿童身体与其环境表面之间微生物传播的最常见媒介，我们试图查明儿童手掌微生物的潜在来源以及它与幼儿园表面的交叉传播。PCoA分析显示，儿童手掌样本的微生物组成分布明显与地面和物体采集的样本不同（图2A）。有趣的是，在孩子的手掌上观察到大量与口腔微生物群相关的物种，如,,，这可能是由于幼儿的手口接触习惯增加，如咬指甲和/或吮吸手指。
为了深入了解儿童—微生物通过表面进行相互作用的可能性，我们根据所有已鉴定物种的相对丰度，推断所有采样表面之间的微生物相互作用网络。在网络中，确定了三个主要的簇，即厕所地板/游戏室地板簇、儿童手掌/物体簇，游戏室灰尘簇（图2B）。有趣的是，儿童手掌样本与玩具表面和彩色铅笔样本之间的物种共存，这表明幼儿园内部的交叉传播途径是通过儿童的手来介导的。另外，对彩色铅笔、绘本、书包、玩具表面等样品的相互关系进行分析，结果发现，可能是孩子们的手接触导致了细菌的混入。
在此基础上，我们使用贝叶斯方法评估儿童手掌微生物组成的潜在来源，我们发现，玩具表面是主要来源，其在所有样本中的平均贡献为33.68%（图2C），其次是绘本（10.81%）。这一结果支持一个直观概念，即通常被触摸的物体是手上发现的细菌的主要来源，玩具表面和绘本是最常见的接触热点，最有可能成为儿童手掌交叉传播的潜在媒介。
图2 | 七个采地点与儿童手掌样本之间的微生物相关性。（A）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示微生物种类组成存在显著差异（PERMANOVA; R = 0.410, < 0.001）。地面（游戏室灰尘、游戏室地板、厕所地板）、手触摸物体（绘本、书包、玩具表面、彩色铅笔）和儿童手掌形成三个不同的簇。每个点对应一个样本，并根据采样点的颜色进行着色，椭圆对应95%置信区域。（B）基于2号幼儿园样本间的相关性推断微生物相互作用网络，该分析是采用基于各细菌种类相对丰度的SPIEC-EASI完成。样本与样本之间的相互作用按取样地点进行分层。每个节点代表一个样本，颜色表示采样点，网络中没有删除任何一个样本。（C）利用SourceTracker估算各个来源的微生物群落对每个儿童手掌微生物群落的相对贡献。
幼儿园可能存在的潜在病原菌
种水平分辨率微生物群落的阐明，为全面了解幼儿园表面存在的可能有害微生物提供了一个机会，例如，抗性细菌或潜在与人类健康相关的微生物。根据世界卫生组织公布的一份主要病原菌清单，两所幼儿园共检出8种病原菌，其中至少1种病原菌可在74份样本中被检出，总检出率为88.1%（平均相对丰度为>0.001%）。在被检出的病原菌中，铜绿假单胞菌的检出率最高，为98.8%，其次是鲍曼不动杆菌，检出率为52.4%（表1）。
虽然8种病原菌中有5种病原菌在儿童手掌中的检出率>80%，但这些病原菌的相对丰度大多很低，<1%（图3A）。此外，儿童手掌中的潜在耐药菌的相对丰度和微生物组成也存在很大的差异（图2C, 3A）。这可能是儿童个体行为的差异，因为最近的研究表明，人类行为和日常生活习惯在室内环境中细菌传播和微生物组成的波动中起着重要作用（Wang et al., 2021; Wilkins et al.,2021）。在玩具表面发现潜在耐药菌的比例（平均41.2%）是其他物体表面（平均20.9%）的两倍，这表明玩具很容易被忽视，应该通过频繁的卫生干预来解决这一问题。
参考中国疾病预防控制中心公布的299种机会致病菌来确定可能影响人类健康的微生物。在所有样本的优势属中（>90%的已鉴定种）共鉴定出34种潜在致病菌（每种细菌的平均相对丰度为>0.001%），包括,,,, （图3B）。特别是，儿童手掌样本携带的病原种类最多，而地板样本携带的病原种类最少。值得注意的是，这些细菌在之前儿童保育和日托中心的研究中已经观察到，它们主要与呼吸道感染（如Streptococcus pneumoniae，Haemophilus influenzae）、胃肠道感染（如Helicobacter pylori，Enterococcus faecalis）和口腔健康（如Actinomyces naeslundii、Streptococcus mutans，Streptococcus oralis）有关。为了定量地了解表面的潜在病原菌种类，把每个个体鉴定到的34种潜在病原菌的相对丰度相加，得到潜在病原菌的累积相对丰度。
值得注意的是，2号幼儿园不同地点的潜在病原菌的累积相对丰度显著低于儿童手掌的潜在病原菌的累积相对丰度（ = 4.18 x 10, Kruskal Wallis）（图3C）。这表明儿童的手可能比通常认为很脏的表面（如厕所地板）含有更多的潜在致病菌，强调了幼儿园需要更高标准的卫生标准来进行适当的卫生控制。
图3 | 幼儿园表面存在的潜在有害微生物。（A）平均相对丰度为>0.001%的潜在耐药菌在儿童手掌上的分布情况（n = 15）。（B）在7个采样地点和2号幼儿园的儿童手掌中，观察到具有潜在人类健康问题的微生物，其累积相对丰度存在显著差异( = 4.18 x 10, Kruskal Wallis)。以儿童手掌为参照组，玩具表面 ( = 0.0357)、绘本 ( = 0.0080)、厕所地板 ( = 0.0107)、游戏室地板 ( = 0.0146)、游戏室灰尘 ( = 2.58 x 10)的病原菌相对丰度明显较低。箱线图上的p值采用Mann-Whitney U检验得出；n.s.，不显著，*≤0.05， **≤0.01， ***≤0.001。（C）在幼儿园七个不同取样地点和儿童手掌确定的可能影响人类健康的微生物热图，该热图仅包括各采样点平均相对丰度为>0.001%的物种。
总结
本研究首次采用2bRAD-M技术，克服了室内环境样本中微生物群落生物量低的挑战，建立了幼儿园室内微生物群落的无偏图，以及室内场所与人类居民之间的微生物传播。这使得幼儿园表面细菌混合的推断成为可能，这可能是通过与孩子们的手接触来实现的。具有潜在人类健康问题的细菌种类和耐药菌主要集中在儿童的手上，而不是在环境场所，这突出了幼儿园良好的手卫生习惯的重要性。此外，了解物体表面，如玩具，携带大量的病原体，应有助于确定具有风险的地点，并促进幼儿园室内卫生风险管理方法，以最大限度地减少有害微生物在室内的传播。在此基础上，针对多个地点、时间和居住因素进行大规模的研究，有助于确定幼儿园健康生态系统的基线，最终制定幼儿与室内环境健康共生的合理策略。
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END本文系青岛欧易原创
