一区顶刊 | 转录组测序+蛋白组学探究肿瘤细胞通过 RB1CC1 介导的转录重编程对铁死亡敏感-欧易生物

前言

近日，同济大学附属第十人民医院孙奋勇教授、上海交通大学石毅副研究员、上海市胸科医院王佳谊研究员作为共同通讯作者，在 Clinical and Translational Medicine (IF: 11.492) 杂志发表了题为“Tumour cells are sensitised to ferroptosis via RB1CC1-mediated transcriptional reprogramming”的研究论文，报道了肿瘤细胞通过 RB1CC1 介导的转录重编程对铁死亡敏感。

薛翔飞、马丽芳、张骁博士为论文的共同第一作者，文章中转录组测序、蛋白鉴定、ChIP-seq 及分析服务由欧易生物完成。

研究背景

铁死亡是一种调控细胞死亡形式，其特点是细胞内脂质活性氧(ROS)过度依赖铁的积累导致线粒体发生变化。触发铁死亡可以有效地治疗对促凋亡和其他常规抗肿瘤治疗耐药的肿瘤细胞。因此，研究铁死亡已成为肿瘤研究领域的一个新的热点和重要课题。然而，使肿瘤细胞对铁死亡敏感的信号通路和因素仍不明确。

研究内容

本研究对肝癌细胞进行RNA-seq和蛋白质组检测，确定目标分子RB1CC1。后续根据免疫印迹和免疫组织化学分析RB1CC1和相关蛋白的表达。通过构建一系列RB1CC1突变体来确定RB1CC1的亚细胞定位，研究RB1CC1核易位对铁死亡信号调节的机制。随后为了检测肿瘤细胞中铁死亡和 RB1CC1 依赖的转录程序，进行了ChIP-seq测序。最后作者构建肝癌小鼠模型去评估JNK激动剂对加强咪唑酮雌激素(IKE)治疗的影响，进而阐明RB1CC1在基于IKE的肝肿瘤发生治疗中的重要性。

研究思路

研究结果

RB1CC1使肿瘤细胞对铁死亡敏感

为了筛选潜在的脂质ROS调控和铁死亡相关因子，对erastin（脂质ROS和铁死亡诱导剂）和Fer-1（脂质ROS和铁死亡抑制剂）处理的肝细胞癌(HCC)HepG2细胞同时进行了RNA-seq和蛋白质组学研究，获得了6个可能与脂质ROS的产生和铁死亡有关的候选分子（图1A）。在沉默 RB1CC1后，HepG2细胞对由erastin 和RSL3（铁死亡诱导剂）诱导的细胞死亡变得不敏感（图 1B）。

作者接下来评估了 RB1CC1 在一系列用 RSL3 和erastin 处理的癌细胞系中的表达，发现 RB1CC1 在多种癌细胞系中表达增加且呈现时间依赖性的上调（图 1C-D）。RB1CC1敲除使HepG2细胞对铁死亡脱敏，RB1CC1过表达导致脂质ROS的增加（图 1E-F）。这些结果强烈表明，RB1CC1与肿瘤细胞中的铁死亡相关。

构建IKE处理后的Rb1CC1–/–、Rb1CC1+/-和WT小鼠模型（图 1G-I），进一步证明铁死亡相关的脂质过氧化是RB1CC1依赖性的。RB1CC1敲除导致了CDX的生长加速。此外，RB1CC1敲除组的IKE并不像对照组那样抑制肿瘤生长并诱导脂质过氧化（图 1J-L）。

这些发现共同支持 RB1CC1 可能参与铁死亡的信号调节。

图1 | RB1CC1使肿瘤细胞对铁死亡敏感

核易位的RB1CC1作为一种铁死亡调节转录因子

为了探究RB1CC1 如何参与铁死亡的信号调节，通过RB1CC1 敲除/过表达发现可以减轻/增强RB1 mRNA 表达（图 2A），随后通过ChIP实验，发现 RB1CC1 被募集到用RSL3和erastin处理细胞中的 RB1 启动子中的 RB1CC1 结合区 (RBR)（图 2B），表明 RB1CC1 可能作为转录因子，在触发铁死亡时增强靶基因的转录。

通过检测在铁死亡诱导后RB1CC1的细胞定位以及细胞分离实验，发现 RB1CC1在触发铁死亡后从细胞质转移到细胞核中（图 2C-D）。其中，RB1CC1中的499-548位氨基酸区域对于铁死亡诱导的RB1CC1核易位至关重要（图 2E）。

通过磷酸化蛋白凝胶检测，RB1CC1在499-548位氨基酸区域，S537A突变能消除了RSL3和erastin治疗后RB1CC1的超移（图 2F-H），细胞定位实验和细胞死亡检测也均表明RB1CC1在S537残基处以铁死亡依赖的方式被磷酸化（图 2I-J）。

以上证明RB1CC1的铁死亡诱导的核易位与S537残基的磷酸化有关，对肿瘤细胞的铁死亡敏感至关重要。

图2 | RB1CC1的核易位使细胞对铁死亡敏感

RB1CC1涉及H4K12Ac组蛋白修饰在刺激增强子依赖性转录中的新作用

为了探讨rb1cc1在铁死亡触发后的转录活性的机制，IP实验后进行蛋白鉴定，组蛋白H4被鉴定为RSL3/erastin诱导的rb1cc1相关蛋白（图 3A）。组蛋白乙酰化与转录重编程密切相关，本研究发现位于RB1启动子内的RBR周围的H4K12Ac水平以铁死亡和RB1CC1依赖的方式升高（图 3B）。

随后，在HepG2细胞中使用抗rb1cc1和抗h4k12ac抗体进行ChIP-Seq，发现RB1CC1占据了5个新的峰，被实验证实与RSL3和erastin有关，并伴随着H4K12Ac组蛋白修饰的显著增加（图 3C-E）。通过基序分析和荧光素酶报告实验，表明铁死亡诱导的增强子活性可能依赖于RB1CC1与FOX基序的相互作用（图 3F-G）。

根据RNA-seq结果，RSL3处理后SEC3、CYTH3、MEPCE、CYREN、CHCHD3、TPD52、SLC25A32、MYC和VRK3表达上调，是潜在的铁死亡相关基因（图 3H）。通过3C实验确定了RB1cc1相关增强子和铁死亡相关基因启动子之间的相互作用（图 3I-J）。

这些结果揭示了增强子结合对于RB1CC1刺激铁死亡相关基因的表达至关重要。

图3 | RB1CC1与H4K12Ac连接，介导铁死亡相关和增强子依赖的转录

RB1CC1通过其靶基因调节线粒体和铁死亡

通过对转录和蛋白组数据整合以及对线粒体ROS检测，RB1CC1可能通过其靶基因CHCHD3以线粒体依赖的方式使细胞对铁死亡敏感（图 4A-C）。在缺乏线粒体DNA的细胞系中过表达CHCHD3，发现线粒体至少是RB1CC1和CHCHD3对铁死亡敏感的关键（图 4D-F）。

根据MMP和细胞死亡检测，RSL3和erastin处理后，CHCHD3敲除使RB1CC1对MMP的刺激无效（图 4G-J）。体内实验进一步证明，IKE诱导的Chchd3表达是Rb1cc1依赖的，同时，Rb1cc1对于RSL3和erastin诱导的Chchd3的上调是不可或缺的（图 4K-M）。

这些结果表明，CHCHD3作为RB1CC1的下游效应分子，决定了线粒体功能和铁死亡。

图4 | RB1CC1靶基因与线粒体相关

ELP3与RB1CC1相互作用，调节H4K12Ac组蛋白修饰和铁死亡相关转录程序

通过蛋白组学检测寻找rb1cc1相关的组蛋白调节因子，锁定RSL3和erastin均可诱导的EPL3蛋白为相关因子（图 5A）。ChIP和Re-ChIP实验表明，RSL3和erastin处理后，两种与线粒体相关RB1CC1靶基因CHCHD3和SLC25A32通过ELP3诱导表达（图 5B-E）。

通过3C实验和ChIP检测，在ELP3敲除细胞中，ELP3对于SLC25A32和CHCHD3这两个基因的启动子和增强子的关联是不可或缺的（图 5F-G）。这表明ELP3对RB1CC1刺激铁死亡相关的转录重编程至关重要。细胞共定位和细胞死亡实验结果表明，RB1CC1和ELP3依赖C端相互作用，对于使肿瘤细胞对铁死亡敏感至关重要（图 5H-J）。

图5 | ELP3对于RB1CC1介导的铁死亡相关转录重编程至关重要

JNK激活刺激RB1CC1使铁死亡敏感并抑制肿瘤发生

使用多种药物处理对铁死亡的敏感性低的A549细胞，确定了PTX、Cllolar、OXA和TMZ这四种可协同诱导RB1CC1核易位的药物（图 6A-D）。通过亚细胞定位和磷酸化蛋白凝胶检测，这四种药物均可磷酸化和激活JNK，使用JNK抑制剂可阻止JNK和RB1CC1的磷酸化，而RB1CC1的磷酸化对其核易位至关重要（图 6E-G）。这表明JNK激活物倾向于增强RB1CC1的磷酸化及其核易位。

ChIP实验结果表明，JNK抑制剂阻止了RSL3-和erastin诱导的RB1CC1和ELP3的富集和H4K12Ac的升高，CHCHD3增强子-启动子关联也被消除，CHCHD3和RB1 mRNA也观察到类似的结果（图 6H-I）。JNK抑制剂可减轻RSL3和erastin诱导的MMP、mitoROS的生成和细胞死亡（图 6J）。IKE与PTX、Cllolar、OXA和TMZ共同给药可抑制肿瘤生长（图 6K）。

图6 | JNK的激活增强了RB1CC1对铁死亡敏感的作用

本研究的临床和转化意义

组织样品芯片检测和免疫组化分析，RB1CC1在肺癌队列中也表达上调（图 7A-B）。根据RB1CC1的细胞定位，将肺癌样本分为细胞质亚型、核亚型和质/核亚型，免疫组化分析显示细胞核亚型的4-HNE水平最高（图 7C-E）。大部分检测的肺癌样本为RB1CC1核定位，核定位的原代LUSC细胞对铁死亡的敏感性也较高（图 7F-G）。

作者发现DEN/ccl4在WT和RB1CC1+/-小鼠肝癌模型中诱导肝肿瘤发生的能力相似（图 7H-I）。在RB1CC1+/-小鼠中，IKE对肿瘤生长的抑制作用显著降低，生存结果也受到了影响（图 7J-K）。

总之，RB1CC1对于基于铁死亡的抗肿瘤治疗的疗效至关重要。