2020年10X Genomics空间转录组学研究平台一经推出，就备受科研人员的青睐。那么，作为一个日益火爆的科研技术平台，空间转录组学的科研魅力体现在哪里?它为众多科研工作者带来了哪些机遇?又能帮助我们解决哪些问题?相信随着大家对空间转录组学的逐渐了解，对这些问题的答案已经有了不同程度的认知。
在往期文章中，我们已经为大家介绍了空间转录组的样本准备相关注意事项，今天小欧带领大家继续探索10X Genomics空间转录组学在植物科学研究中的神奇魅力，为您揭开“空间转录组学——植物篇”的神秘面纱。
植物样本常见类型与特点
相较于动物组织而言，植物样本的类型更为复杂多样。即使是比较常见的芽尖、茎段、叶脉、果实、根等组织，也会因其样本种属来源不同，而在组织形态、细胞大小、细胞类型、细胞壁组分、所含代谢物种类与含量等方面存在很大的差异，对实验条件的优化需求也不同。因此，在空间转录组实验操作过程中，针对不同物种来源的同一类植物器官或组织，往往需要多次尝试和优化才能得到最佳的实验结果。
植物样本包埋
常规动物样本的包埋送样一般既可以用新鲜组织也可以用冰冻组织。而对于植物样本，由于组织中含水量比较高，冰冻后形成的冰晶对后期实验影响很大甚至直接导致实验失败，因此植物样本一般不能用冰冻组织进行包埋。
对于新鲜植物组织的包埋，也有2种方式可以采用：
（1）新鲜样本直接包埋；
（2）新鲜样本抽真空后包埋。
由于植物组织内部含水量比较大，而且大部分植物样本具有特殊的内部组织结构，如细胞壁、种皮包裹，根、茎等组织中的韧皮部与木质部结构等，给组织切片的完整性带来很大的困难。根据我们的项目经验，对于切片要求比较苛刻的样本，小欧建议选择第（2）种包埋方式，相较于新鲜样本直接包埋，第（2）种方式虽然多了一个抽真空的步骤，但对植物样本切片的完整性会有比较明显的提升。
植物新鲜样本抽真空后包埋的主要操作步骤如下：
1）准备好包埋盒、OCT包埋胶、双面刀片、镊子、无尘纸等包埋耗材；
2）准备好待实验的植物样本，将样本按照研究目的所需的方向进行切割并修整到合适包埋的大小；
3）将OCT包埋胶挤出适量在包埋盒底部中，用镊子将新鲜植物样本放在OCT包埋胶中，可用镊子轻轻将样本按压，使样本完全浸没在OCT包埋胶中；
4）将装有样本的包埋盒放入密封装置中抽真空2min，若样本周围有很多小气泡存在，可用小枪头或者注射针头将小气泡赶走或者戳破；
5）取出抽真空后的样本置于-80℃或者-20℃缓慢冻存；
6）待OCT完全冻好，取出放入切片机样本室内，孵育后即可以开始切片。
切片
对于植物样本的空间转录组项目而言，可以毫不夸张地说，切片贴片可是个技术活！不同物种不同来源的植物样本各有各的特点，有的具有丰富的导管结构，有的含水量非常大，有的包裹着种皮或萼片，有的含有大量淀粉或糖分......这些特殊结构或组分给切片贴片带来很大困难。
如何尽量避免或者减少这些现象带来的切片影响，是我们首先要解决的问题。对此，小欧已经积累了比较丰富的项目经验，并针对实验细节和注意事项进行了详细梳理。在此，请允许小欧先卖个关子，相关“秘籍”将在下一篇中为您揭晓哦！
染色
染色的目的是为了能够清晰地辨别出组织结构，以辅助我们判断所关注的结构或细胞类型是否存在以及状态如何。组织染色方法有多种，苏精-伊红（HE）染色是动物组织形态学和病例组织学中最常用的染色方法。在空间转录组研究中，动物组织切片也是用HE染色。但HE染色在很多植物样本中染色效果并不好，因此，植物样本更倾向于选用苯胺蓝染色。下面小欧为大家介绍空间转录组平台上经常用到的这两种染色方法。
1. HE染色方法实验步骤
(1)将贴片后的玻片放置在PCR适配器上，贴有组织的一面朝上， 37°C孵育1min。
(2)将玻片完全浸入-20°C预冷的甲醇中，盖紧管盖，于-20°C固定30min。
(3)从甲醇中取出玻片，加入500 µl异丙醇均匀覆盖玻片上的所有组织区域，室温孵育1min。
(4)弃去异丙醇，风干玻片，不超过 10min。
(5)加入1ml苏精，均匀覆盖所有玻片上的组织，室温孵育7min。
(6)弃去苏精，玻片浸入50ml离心管5次，玻片浸入第一个800ml纯水中15次，然后浸入第二个800ml溶液中15次。
(7)擦去玻片背面多余的液体，加入1 ml Bluing缓冲液，均匀覆盖所有组织切片，室温孵育2min。
(8)弃去Bluing缓冲液，玻片浸入第二个800ml纯水中5次。
(9)擦去玻片背面多余的液体，加入1 ml伊红染色液，均匀覆盖所有组织切片，室温孵育1min。
(10)弃去伊红染色液，玻片浸入第三个800ml纯水中15次。
(11)擦去玻片背面多余的液体，风干直至组织不透明后，37°C孵育5min。
(12)扫描成像
注意事项：
（1）伊红染色液需要用tris-base/乙酸:伊红原液=9:1进行配置。
（2）由于植物样本的粘附性较差，染色过程中容易脱片，部分组织已脱落，或者着色不显著，染色过程中可根据每一步的染色情况进行微调，尽量保证组织完整性。
2. 苯胺蓝染色方法
目前植物样本采用的苯胺蓝染色方法为粗染。所谓“粗染”，是指根据植物样本种类不同，将苯胺蓝染液母液稀释不同倍数（一般可稀释20x、30x或40x）,将染色液滴加到切片上覆盖所有组织部位，室温染色1min。然后，用纯水从玻片一端慢慢洗去染液。将染液轻柔冲洗干净后，待组织上水分完全蒸发即可扫描。
很多植物样本在染色后可能由于洗涤的关系，染色后会有部分组织不完全，比如带有花粉花药的贴片，在染色后花粉或者花药有些许晕染效果，可能就是染色过程中洗涤掉了部分花粉和花药。还有部分样本在染色后会造成染液堆积在部分组织上，也和染色过程中细微的操作及切片本身有很大关系。因此，染色后需充分洗涤以去除浮于组织表面的染料，同时也要注意动作轻柔，尽量不要用流水冲洗，因为流水洗涤的冲击力较大，在粗染的情况下，容易把玻片上的组织冲掉，造成组织不完整甚至脱片。
以上就是小欧为您整理的空间转录组植物样本包埋、切片、贴片、染色的基本实验流程和关键注意事项，想了解更多样本处理的实验细节，请多关注我们的公众号，或者来我们欧易生物单细胞事业部空间转录组平台参观交流哦！
长按扫码
咨询欧易生物技术工程师
猜你想看
End本文系欧易生物原创
