在上一篇中我们介绍了利用10xGenomics空间转录组平台研究植物样本时，从样本包埋到玻片染色的基本实验流程。本文中，小欧针对实验流程中最为关键的步骤——切片和贴片实验中的一些操作小技巧进行了整理，希望能帮助大家更好地开展植物空间转录组学的项目研究。
切片注意事项tips
tip1：新鲜植物样本包埋后，内部的结构组织也相对比较脆弱，已经使用过的刀片可能已经存在肉眼无法看到的小伤口，会直接体现在植物组织切片的完整性上。因此，对于植物样本，在常规切片的基础上，应尽量使用新刀片，以减小对组织切片的机械损失。
tip2：由于植物组织的脆弱性，切片过厚更易造成对组织表面的损伤，导致组织切面上产生大小不一的空洞。并且，切片过厚容易使目标区域被错过，造成切片浪费或者切片样本损失过多。因此，在调整切片角度、寻找最佳目标区域的切片样本处理过程中，可以将切片厚度调整得薄一点，比如设定为10um左右。
tip3：多数情况下，植物样本的特化结构远比动物组织样本还要复杂。因此，在正式切片前的切片预调整阶段，务必要边切边随时注意观察组织结构的变化。必要时，应贴片后在显微镜下观察组织切片的情况，根据切片的实时效果来确定如何调整切片的角度。
tip4：切片过程中，如果遇到组织切面有大小不一的空洞，可能是组织内部本身就具有的导管结构，也可能是由于组织表面质地较硬，OCT包埋胶无法渗入组织内部，起到支持和保护作用而造成的，还有可能是切片时的力度或者切片速度不合适而造成的机械损伤。遇到这种情况，可以在切面上再稍微包裹一层OCT包埋胶，完全覆盖住组织表面即可，不用过多，使OCT逐渐渗入到组织内部，达到一定程度上的支撑作用。重新切片时能够起到缓冲作用，可以在一定程度上改善组织切片的完整性。
tip5：在即将切到目标区域时，每次切掉的厚度会直接影响组织剩余量。此时，可调整切片厚度到5-8um左右，尽量减少组织材料的浪费，当切到目标区域时再及时调整切片厚度恢复至10um即可。
tip6：由于有些植物样本外有一层较硬的种皮或者萼片，阻止了OCT包埋胶的渗入，切片时可能造成组织切片和OCT包埋胶脱节的现象。遇到这种情况的时候，如果这些组织不属于研究对象，则在样本前期处理时，应在不伤及组织内部结构的基础上小心去除此部分结构；若这些组织也属于研究对象，则应注意每次切片下刀时的用力程度，应该根据每个样本的不同特点而有所区别。有些样本适合一刀到底，快速切片，有的样本却需要缓慢控制每次下刀时的力度，才能减轻对组织切片的伤害。
tip7：由于植物样本结构的复杂性，对于有些样本，可能每次切开的层面都不尽相同，如果遇到比较难切的样本，切面容易破碎，可能会造成每张切片的破碎层度都不尽相同。遇到这种现象，我们只能尽量对切面进行修补以减轻对后续切片的影响。在切片完成后，用OCT包埋胶将剩余组织的切面完全包裹覆盖，一方面可以减轻样本切面在冰冻过程中可能产生的二次冻伤，另一方面则可以减少下次切开此样本时，由于重新调整切片角度而造成的样本浪费的问题。
贴片注意事项
切片完成后并不意味着整个切片过程就结束了，如何把样本切片又快又好的贴到玻片上，尤其是正式玻片的特定有效捕获区域内，也是确保后续实验顺利进行的关键问题。
对于动物样本，虽然有些疏松结缔组织或脂肪组织样本在切片时也会出现易破碎的现象，但对于大部分比较致密的结构组织样本，切片和贴片相对比较容易，对组织修片（调整组织大小）也相对简单些。但对于植物组织样本而言，则需要关注到更多操作细节。
首先，如何将组织修片到特定的大小范围内就是个难点。植物样本结构比较脆弱，在修片过程中非常容易被破坏。因此，为减少修片造成的结构损伤，需注意在前期样本包埋阶段，就应尽量把组织大小调整到合适的范围内（10xGenomics正式玻片上，捕获区域为6.5x6.5mm/样本），避免样本过大。如果已经出现了样本过大、贴片时会影响到捕获区域的贴片效果的情况，则必须进行适当修片操作。此时，可尽量用刀片轻轻按压来减轻对组织切面带来的影响，采用边切边修的方式，不可一次性修掉太厚组织。
其次，如何将切片展开并完整地贴到玻片上也是需要注意的细节。有些样本在切片展开的过程中容易被拉扯到，造成组织结构破碎、有缝隙或者裂痕、组织边缘卷边、组织大范围卷曲折叠等，甚至有部分组织会与其他部分脱落，更严重的也可能造成整个切片因破碎程度较大而无法使用。这种情况就到了考验我们的贴片技术水平、经验以及耐心的时候，不同的操作人员有不同的经验和操作习惯，也存在着一些个人小技巧，需要具体情况具体分析，很难梳理成一个标准SOP。
小欧在众多项目的磨练下，在这方面已经积累了相当丰富的经验，可以在很大程度上为珍贵样本保驾护航，也欢迎更多植物领域的科研小伙伴来和小欧交流讨论！
长按扫码
咨询欧易生物技术工程师
猜你想看
END本文系欧易生物原创
