2022年11月4日，复旦大学附属肿瘤医院超声科常才团队联合Åbo Akademi大学Hongbo Zhang、肿瘤研究所唐爽团队于Bioactive Materials (IF:16.874)在线发表了仿生纳米颗粒在探究三阴乳腺癌中剪切波弹性硬度机制上的新研究成果，提供了对乳腺癌SWE成像硬度机制的全面描述，以及基于SWE成像的新辅助治疗效率预测模型。
期刊：Bioactive Materials
影响因子：16.874
发表年月：2022-11-04
材料：取6例小鼠的肿瘤组织进行单细胞测序
方法：10x Genomics单细胞3端测序
研究背景
乳腺癌的发病率逐年提高，2020年乳腺癌全球新发病例约230万，是影响全球女性健康的首位高发癌症。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)三阴性乳腺癌（TNBC）是一类侵袭性高、易复发转移、异质性强、缺少治疗靶点的乳腺癌，约占全部乳腺癌的10-17%。大多数患者在临床诊断为TNBC时已经处于晚期阶段。因此，开发一种临床工具来预测患者对新辅助治疗的敏感性以辅助临床医生制定治疗方案非常重要。
肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是实体瘤的组成成分，在肿瘤的发生发展和转移中发挥重要作用。有报道称，乳腺癌中CAFs含量一定程度的影响剪切波弹性（SWE）硬度。SWE成像是超声波敲击不同弹性系数组织时产生不同剪切波的过程，其成像特征与肿瘤病理特征具有相关性。青蒿琥酯(Artesunate，ARS)是青蒿的衍生物，具有良好的抗肿瘤潜力。将ARS与化疗或免疫治疗药物联用，同时干预CAFs和癌细胞，可能会获得更好的治疗效果。
近年来，纳米医学发展迅速，带有肿瘤细胞膜的仿生纳米颗粒已被广泛应用于提高纳米药物在体内的循环和肿瘤靶向能力，已成为研究热点。通过工程仿生纳米颗粒增强ARS对肿瘤的抗纤维化作用，重塑TME，有助于我们更好地理解SWE硬度与CAFs之间的关系。
在本研究中，作者分析了233例患者的SWE图像和病理指标，以及100例患者的乳腺癌组织。作者建立了初步的SWE预测模型，并制备了仿生纳米颗粒，以阐明其决定肿瘤SWE成像硬度的机制。作者还使用单细胞测序技术进一步阐明了其机制，并验证了研究结果。总之，作者提供了对乳腺癌SWE成像硬度机制的全面描述，以及基于SWE成像的新辅助治疗效率预测模型。
研究结论
Result1 SWE影像学对TNBC患者的新辅助反应效率的预测
作者对233例患者的病理指标和肿瘤SWE硬度进行分析，其中非TNBC的患者102例，TNBC的患者131例。首先，建立了由临床病理医师对病理指标Ki67和CD8评分系统。过SWE成像测量了肿瘤硬度，分析肿瘤硬度值与病理评分( Ki67评分+ CD8评分)的相关性。与非TNBC相比，TNBC具有更高的肿瘤硬度( p < 0.0001 )和Ki67表达( p < 0.0001 )，以及更低的CD8浸润( p < 0.01 )。基于文献报道，作者选择将α-SMA作为CAF标志物。随后，对50例TNBC的患者和50例非TNBC患者的癌组织样本进行α - SMA染色，以评估它们之间的纤维化程度。结果表明，TNBC肿瘤确实比非TNBC肿瘤具有更高的纤维化。肿瘤硬度与新辅助治疗的缓解率有很强的相关性，R平方为0.811，p = 0.0000113，证明这种相关性具有很好的可靠性。以上结果表明SWE成像在预测新辅助治疗上具有良好潜力。
Result2 仿生纳米粒子的表征
作者设计了细胞膜修饰的纳米粒( 231M-NPs 和 E0771M-NPs )来改善ARS在不同小鼠肿瘤模型中的蓄积。首先，作者验证了纳米颗粒具有良好的同源靶向能力和同源靶向作用；进一步，量化了细胞内吞的仿生纳米颗粒的数量，描绘了细胞边缘并量化了细胞中的光强度。通过场发射透射电子显微镜( FETEM )成像显示231M - ARS @ PLGA纳米粒( 231M-AP NPs)呈球形，直径约150 nm 。多分散指数( PDI )也表明纳米粒具有良好的粒径均一性。稳定性结果发现，纳米粒子在200 ~ 300nm之间均一性较好，当细胞膜：纳米粒子重量比为1：1时，仿生纳米粒子均一性和稳定性较好。对231M - NPs的元素分析显示纳米颗粒上存在磷和氧元素，证明膜成功修饰在纳米颗粒上。
Result3 体外ARS介导的成纤维细胞抑制作用
作者对6株人乳腺癌细胞系( MDA - MB - 231、MDA - MB - 468、SK - BR - 3、AU565、MCF - 7、T - 47D)、1株小鼠TNBC细胞系( E0771 )和3株成纤维细胞( CAFs、L929、HMEC)进行了CCK - 8实验。结果发现，231M-APNPs、ARS、AP NPs无明显细胞毒性，推测在实体瘤中的抗肿瘤作用是由于其抗纤维化作用。随后，为了验证ARS的抗纤维化作用，作者利用免疫荧光和western blot实验在细胞水平评估了ARS的作用。结果发现，用231M - APNPs处理成纤维细胞后，Vimentin和α - SMA表达显著下降，231M-AP NPs与纳米粒共孵育后抑制CAF相关蛋白的表达。以上实验结果表明，ARS对CAFs具有抑制性。
Result4 青蒿琥酯的体内抗肿瘤作用
作者将MDA - MB - 231异种移植瘤( n = 40)小鼠随机分为4组：对照组、ARS组、AP NPs组和231M - AP NPs组。ARS组和231M - AP NPs组在治疗27天后仅表现出微弱的抗肿瘤作用，231M-AP NPs表现出比ARS更低的副作用。第25天，采用SWE成像对各组肿瘤进行评估，结果发现在两组肿瘤大小没有统计学差异的情况下，231M-AP NPs和ARS组肿瘤硬度低于对照组和AP NPs组，说明抑制CAFs功能能够逆转肿瘤硬度。作者还验证出ARS和231M - AP纳米粒可以抑制CAF功能从而改变肿瘤微环境。随之，作者对所有肿瘤样本的免疫荧光切片进行染色，并使用Image J对HIF - 1 α和α - SMA对应的荧光强度进行量化。HIF - 1 α和α - SMA在ARS和231M - AP NPs组中显著下调。与其他组相比，231M-AP NPs组肝脏炎症程度相对较轻。以上结果表明，231M-AP NPs组在逆转肿瘤硬度和重塑TME方面比ARS组具有更好的效果，这说明仿生纳米粒具有更好的药物递送能力。在接下来的实验中，仿生纳米颗粒将帮助我们更明显地比较抑制CAFs功能所引起的SWE成像变化。
Result5 体内青蒿琥酯介导的化疗增敏
作者设计了231M - ARS / PTX @ PLGA纳米粒( 231M- APP NPs)来验证TME重塑是否可以放大化疗药物的抗肿瘤作用这一假设。结果表明，ARS与PTX联用比单独使用PTX具有更好的抗肿瘤效果，且ARS可以放大PTX的抗肿瘤效果，抗肿瘤效果与孵育时间呈正相关。随后，作者将40只MDA - MB - 231移植瘤小鼠随机分为4组：对照组、PTX组、PTX + ARS组和231M - APP NPs组，治疗21天后，PTX + ARS组和231M - APP NPs组均表现出良好的治疗效果，尤其是231M - APP NPs组；作者还发现231M - APP NPs诱导的副作用比纯药物组合更小。
Result6 体内E0771M - AP NPs介导的免疫治疗增敏作用
作者将60只C57 / B6J小鼠随机分为6组：对照组、ARS组、PD1组、PD1 + ARS组、E0771M - AP NPs组和PD1 + E0771M-AP NPs组。治疗18天后，与PD1、PD1 + ARS和E0771M - AP NPs组相比，PD1 + E0771M-AP NPs组表现出显著的治疗效果。此外，与直接用药物( ARS ) 处理的小鼠相比，用仿生纳米药物( E0771M-AP NPs)处理的小鼠的毒性较低。由于裸鼠不具有健全的免疫功能，不能完全模拟人实体瘤的肿瘤微环境，为了更真实的评估肿瘤硬度来部分源于CAFs的功能状态。然后作者对肿瘤进行了SWE成像，验证了SWE成像硬度是由肿瘤的纤维化程度和CAFs的功能状态共同决定的。对E0771M - AP NPs缓解TME缺氧的机制的研究发现，用ARS或E0771M - AP NPs治疗的肿瘤在肿瘤中显示出血氧增加的趋势。PD1抑制剂激活脾脏产生更多的T细胞，E0771M-AP NPs联合PD1抑制剂能募集更多的CD8 + T细胞进入肿瘤，使血液中CD8 + T细胞的百分比略有下降。定量结果显示，E0771M-AP NPs增加了肿瘤中CD8 + T细胞的浸润。肿瘤组织TUNEL免疫组化分析显示E0771M-AP NPs可抑制肿瘤增殖。此外，免疫组化显示经ARS或仿生纳米颗粒处理的肿瘤中Ki67表达也降低。
Result7 仿生纳米颗粒在体内的分布
作者将吲哚菁绿( ICG )的衍生物Cypate装载到纳米粒中，并设置了7个浓度梯度( 200、100、50、20、10、5和0微克/毫升)，观察NP浓度与荧光强度的关系。经尾静脉注射后，观察纳米颗粒在小鼠体内的代谢行为。与未修饰的纳米颗粒相比，负载Cypate的E0771MNPs表现出更明显的肿瘤靶向效果。肿瘤的荧光曲线显示，随着循环时间的延长，纳米药物在肿瘤中的蓄积量逐渐增加；且E0771M - NPs组与NPs组相比差异显著。在6 h时，E0771M - NPs仍有肿瘤蓄积，但大部分滞留在肝脏、脾脏和肾脏。为了进一步检测纳米颗粒在肿瘤内的蓄积情况，作者使用负载染料的纳米颗粒，在尾静脉注射后的第1小时和第4小时获取肿瘤切片。在注射后的第1小时，大部分的纳米颗粒残留在血管中，但在注射后的第4小时，更多的纳米颗粒聚集在肿瘤间质中。纳米颗粒大多通过内皮细胞的内吞作用进入实体瘤；完成跨内皮转运几乎需要4 h，这先前的报道是一致的。
Result8 单细胞测序确定CAFs影响SWE硬度的机制
为了探索肿瘤SWE硬度与CAFs之间的关系，作者从Control、PD1和PD1 + E0771M-AP NPs组中各选取2只小鼠，对每个肿瘤进行了单细胞测序。将细胞分为17组，根据特定的Maker基因将所有细胞分为12个cluster，细胞类型主要为：T细胞、巨噬细胞、上皮细胞、CAFs、自然杀伤细胞( NK )、血管内皮细胞( vEC )、树突状细胞( DC )、中性粒细胞、平滑肌细胞( SMC )、B细胞、浆细胞和肥大细胞。与其他两组相比，PD1 + E0771M-AP NPs组血管内皮细胞( vECs )增加。通过Maker基因( Mmp2、Apod、Dcn和Col1a1)在所有细胞中鉴定出癌症相关的成纤维细胞。CAF细胞按基因表达进行聚类，分为9个cluster。随后，作者观察了每种CAFs的所有表达基因中可富集到这些通路的基因数目，以评估这些通路与不同类型CAFs之间的关联。ECM CAFs和伤口愈合CAFs主要影响细胞外基质合成，进一步证实了肿瘤硬度与CAFs的含量和功能状态有关。
此外，作者还对T细胞、巨噬细胞和vEC进行分析鉴定，以研究E0771M - AP NPs对TME重塑的影响。将T细胞划分为10种cluster，E0771M-AP NPs增强了肿瘤中CD8 +记忆性T细胞的浸润。为了在多个维度评估TME重塑，评估了6个巨噬细胞簇的巨噬细胞极化评分。与对照组相比，PD1组和PD1 + E0771M-AP NPs组的M1型巨噬细胞比例增加。通过对血管内皮细胞( vEC )的鉴定分析，发现ARS增加了炎性EC的比例。因此可以假设含有炎性内皮细胞的血管能够促进免疫细胞渗入肿瘤并增加血氧供应，以减轻缺氧问题。综上所述，通过单细胞测序，证明了E0771M - AP NPs可以重塑TME，肿瘤SWE硬度与CAFs的功能状态密切相关。
Result9 基因通路的GO富集分析
为了明确E0771M - AP NPs逆转肿瘤SWE成像硬度和减轻TME缺氧的具体通路，作者对PD1组和PD1 + E0771M-AP NPs组CAFs进行差异基因富集分析，分析比较了两组CAFs的基因，筛选了差异基因，并进一步分析了两组间血管内皮细胞中的差异基因。通过上述分析进行GO富集分析，各组CAFs的通路变化主要集中在细胞外基质。E0771M-AP NPs可通过抑制CAFs功能减少细胞外基质和胶原分泌。PD1 + E0771M-AP NPs组含胶原细胞外基质通路相关基因集高于PD1组，表明E0771M - AP NPs主要影响该通路。而PD1 + E0771M-AP NPs组肿瘤内的氧运输和对自然杀伤细胞趋化性的正向调节增强，再次证实了肿瘤SWE成像硬度受到CAFs分泌的细胞外基质的影响。
作者进一步分析了两组间血管内皮细胞中的差异基因，发现重塑肿瘤微环境后，血管内皮细胞的氧转运能力以及对血红蛋白复合物的亲和力和氧载体活性均增强，有效减轻了肿瘤细胞的缺氧问题。伤口愈合CAFs与nfkb1相关性更高，介导肿瘤慢性炎症的发生，促进肿瘤的侵袭和生长。Xbp1、hivep3、lrf8、lrf2、elf1分别是ECM CAFs和伤口愈合CAFs中最高的调控特异性评分( RSS )。此外，这些调控子均与免疫调节相关。我们推测这两种CAFs亚型在免疫调节中发挥重要作用。
通过细胞通讯分析，发现PD1 + E0771M-AP NPs组的ECM CAFs、伤口愈合CAFs和肿瘤血管之间的联系被显著阻断。相反，在PD1 + E0771M-AP NPs组中，炎症血管与CD8 +记忆T细胞之间的联系显著增强。以上结果表明，这两种亚型的CAFs与肿瘤增殖和免疫抑制密切相关。
文章总结
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，开发一种临床工具来预测患者对新辅助治疗的敏感性以辅助临床医生制定治疗方案非常重要。临床实践结果证明，三阴乳腺癌（TNBC）患者具有更高的剪切波弹性（SWE）硬度，而且TNBC组织中α-SMA的表达高于非TNBC组织。此外，SWE硬度与新辅助治疗反应效率也表现出明显的相关性。为了解释这一现象，制备了TNBC细胞膜修饰的聚乳酸-羟基乙酸( PLGA )纳米粒子，通过抑制CAFs的功能状态，特异性地传递青蒿琥酯来调节SWE的硬度。在MDA - MB - 231和E0771原位肿瘤模型中，231M - ARS @ PLGA纳米粒( 231M-AP NPs)抑制了CAFs功能状态，进一步降低了肿瘤的SWE硬度，并减弱了肿瘤的缺氧，增强了紫杉醇和PD1抑制剂的抗肿瘤作用。
单细胞测序结果表明，产生细胞外基质的两种主要CAFs亚型（ECM CAFs和Wound healing CAFs）能够影响肿瘤SWE硬度和药物的抗肿瘤作用。此外，仿生纳米颗粒抑制CAFs功能可通过增加炎性血管比例和氧转运能力来减轻肿瘤缺氧。因此，作者的发现对于理解CAFs对影响SWE硬度和药物抗肿瘤作用的作用具有基础意义，这为未来可以通过对SWE成像的无创分析，进一步暗示其对新辅助治疗疗效的潜在临床治疗预测具有意义。
欧易生物提供了该项目的单细胞转录组测序实验和分析工作；作者特别致谢了欧易生物的李炼、张苏玲和薛娟在分析方面提供的帮助。
DOI:10.1016/j.bioactmat.2022.10.025
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