2020年10月8日，华中科技大学谌科教授团队于Nature Communications（IF：17.694）在线发表了膀胱癌单细胞测序的相关研究成果。对8例膀胱癌肿瘤样本和3例配对癌旁样本进行了10x Genomics高通量单细胞转录组测序，绘制了膀胱癌肿瘤微环境细胞图谱。
该篇文章重点探讨了iCAFs的炎性作用，发现iCAFs亚群（inflammatory cancer-associated fibroblasts）与临床预后和肿瘤生长增殖等密切相关。以上结果阐明了iCAFs的作用机理，对膀胱癌的治疗提供了新见解。该文章目前是ESI高被引论文，他引次数超过100次。
通过对以上单细胞测序数据的进一步挖掘，团队发现肿瘤来源的淋巴细胞中免疫检查点数量显著增加，进一步分析发现在这些免疫检查点中，CD39与膀胱癌进展显著相关。基于这一信息，团队进行了后续的深入研究。
2022年11月8日，华中科技大学该团队再次于Nature communications ( IF 17.694)上在线发表了膀胱癌单细胞测序揭示CD39i（CD39）抑制剂介导肿瘤微环境改变的研究成果。分别利用C57BL/ 6J（batf3 KO）小鼠和C57BL/ 6小鼠作为实验动物，通过注射和灌注MB49细胞构建了膀胱癌皮下移植瘤模型和膀胱癌原位移植瘤模型。将以上小鼠模型随机分成10-14只/组，随后采用六种方案对各组小鼠进行腹腔内处理，结合单细胞测序绘制了不同处理组的膀胱癌肿瘤微环境细胞图谱，挖掘到CD39与膀胱癌的发展密切相关，并强调了CD39i在肿瘤治疗中的重要性。
该项目的单细胞转录组测序实验和分析结果展示了CD39i介导膀胱癌肿瘤微环境的改变，单细胞数据的进一步挖掘揭示了CD39i抗肿瘤的作用机制，该结果为膀胱癌患者的临床治疗提供了新的研究思路。
基本信息
期刊：Nature communications
影响因子：17.694
发表年月：2022年11月
材料：MB49细胞，C57BL/ 6J（batf3 KO）雄性小鼠，C57BL/ 6雄性小鼠，NTPDase抑制剂多氧钨酸钠（POM-1/CD39i)，单克隆抗小鼠NK1.1抗体，单克隆抗小鼠PD-1（CD279）抗体，CIS，0.5%CMC‐Na或PBS
方法：10x Genomics高通量单细胞转录组测序
研究背景
膀胱癌(BC)是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，世界范围内，膀胱癌发病率位居恶性肿瘤的第 9 位。近几十年来，局部肿瘤切除联合膀胱内BCG免疫治疗一直是NMIBC的一线治疗方法，但总体治疗效果一直不理想，仍有相当比例的患者疾病会复发。而基于CIS的化疗联合根治性膀胱切除术作为MIBC和晚期BC的治疗方案也并不令人满意。免疫检查点抑制剂是解决以上方案缺陷的一种新的治疗策略，已有几种PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂被批准用于治疗MIBC，但该方案客观缓解率仅为13–25%，因此，迫切需要开发新的BC治疗靶点或联合治疗策略。
肿瘤微环境(TME)是潜在的BC治疗靶点，作者所在的团队之前通过对8个BC肿瘤样本和3个BC肿瘤样本进行单细胞RNA测序，揭示了肿瘤内部存在的高度异质性。基于对数据的进一步挖掘，发现肿瘤来源的淋巴细胞中免疫检查点数量显著增加，进一步分析发现在这些免疫检查点中，CD39与膀胱癌进展显著相关。本研究旨在利用单细胞测序深入探究CD39在膀胱癌发展过程中的相关性，后续采用不同的治疗手段进一步验证CD39i应用在临床治疗上的可行性，为临床中膀胱癌的有效免疫治疗提供新思路。
研究结果
Result1 CD39在膀胱癌细胞BC中过表达，主要定位于肿瘤间质区，其表达水平与T细胞衰竭呈正相关
作者对之前发表的数据(来自BC患者的8个肿瘤样本和3个肿瘤旁样本)进一步挖掘，发现肿瘤来源的淋巴细胞中免疫检查点数量显著增加，进一步分析发现在这些免疫检查点中，CD39与膀胱癌进展显著相关(附图1B)。
8个BC和3个癌旁样本中的所有细胞通过tSNE降维聚类和经典的marker标记，被鉴定成10个主要的细胞类型，包括：上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞、成纤维细胞、髓样细胞、B细胞、 T和NK细胞、肥大细胞、LYVE1 +细胞和浆细胞（图1A)。进一步探究CD39的分布，CD39主要表达于内皮细胞、SMC和周围髓细胞、纤维细胞和胶质细胞。对BC和癌旁组织进行免疫组化(IHC)染色，发现BC组织中CD39表达明显高于正常膀胱组织(P < 0.001)，此外，CD39表达较高的BC患者预后较差(图1C-E)。
作者发现肿瘤浸润的CD4 +T细胞和CD8 +T细胞均表达了较多的CD39，同时T细胞衰竭的标志—LAG3表达量也有所增加（图1F,G)，说明CD39表达水平与T细胞衰竭特征呈正相关，同时CD39的表达水平与耗竭CD8 + T细胞的比例呈正相关，这意味着CD39与T细胞的功能障碍也存在着一定相关性。
Result2 CD39i在体内抑制BC发展
作者用POM-1治疗小鼠皮下肿瘤模型和小鼠膀胱原位肿瘤模型，结果表明，CD39i能显著抑制肿瘤生长，提高小鼠存活率（图2A-C）。在小鼠原位膀胱癌模型中，作者发现通过CD39i治疗可以显著降低肿瘤的最大横截面积和小鼠的膀胱重量，再次证明CD39i治疗可以显著抑制肿瘤生长（图2D-G）。流式分析结果如图2H–L所示，CD39i治疗显著增加了肿瘤组织中免疫细胞浸润，包括CD45+细胞、CD4+和CD8+T细胞。为了了解CD39i治疗后肿瘤浸润免疫细胞的全景变化，我们从POM-1和PBS处理组中分选CD45+细胞，然后进行单细胞转录组测序。细胞分为了9种主要细胞类型，包括：T细胞、髓细胞、中性粒细胞、树突状细胞（DC）、NK细胞、B细胞、肥大细胞、Ctsk+细胞和恶性细胞。结果表明CD39i和对照组之间CD45+细胞的主要成分没有显著变化，仅观察到CD39i组中T细胞比例有轻微增加（图2M,N),表明CD39i可能会增加所有免疫细胞类型的丰度。
Result3 CD39i激活了cDC1的增殖
作者进一步对DC进行亚群细分，分成了6个亚群，包括：迁移性DC2 (mDC2)、迁移性DC1−CD80 + (mDC1−CD80 +)、cDC1、cDC1-增殖型(cDC1-p)、常规2型树突状细胞(cDC2)和浆细胞样DC (pDC)(图3A-C)。与对照组相比，CD39i治疗肿瘤的DC亚群发生了显著变化，表现为mDC1−CD80+和pDC减少，cDC1和cDC1-p比例显著增加(图3D)。尽管在CD39i处理后，DC亚群的比例发生了相对重塑，但作者没有观察到细胞亚群功能基因的显著变化(图3E-G)。这些结果表明，CD39i只是促进了cDC1的扩增，增加了cDC1的比例，没有对DCs的功能造成明显影响。
Result4 CD39i治疗激活了CD8 + T细胞，促进T细胞增殖
为了进一步研究CD39i介导的T细胞变化，淋巴细胞进一步降维聚类成10个簇，包括：CD8-G2M、CD8-S、CD8-Slfn5、CD8-TRM、CD8-Ifitm1、NK、Th、CD4-Pdcd1、Th17和Treg(图4A-C)。作者发现CD39i引起了免疫细胞绝对数量的增加，其中循环CD8 + T细胞(CD8- g2m和CD8- s)的增加最为显著（图4D）。作者还观察到Treg丰度略有下降，NK细胞比例略有增加。随后，作者通过流式细胞术对NK细胞表型进行了分析，发现CD39i治疗显著增加了CD27+CD11b+和CD27-CD11b+NK细胞的比例，降低了CD27CD11b-和CD27+CD11b-NK细胞比例，表明成熟NK细胞占比增大（图4E,F）。
此外，作者分析了不同CD8 + T细胞亚群的功能变化，结果表明，经CD39i处理后，循环CD8 + T细胞的常见组织标记物(Gzmk和Cd69)下调，而与一系列颗粒酶(Gzmb, Gzmc, Gzme, Gzmf)形成有关的eome和Prf1显著上调(图4G)。结合流式细胞术分析，作者发现CD39i治疗促进了T细胞增殖，并通过分泌更多的颗粒酶B和穿孔素增强了T细胞的肿瘤杀伤能力。综上所述，这些结果表明CD39i激活了细胞毒性T细胞并促进了这些细胞的增殖。
为了探究CD39i是否影响NK细胞、cDC1和T细胞之间的通信网络，作者构建了细胞-细胞通信网络，发现cDC1和mDC1表达的Il15、Il12b、Cd80和Cd86，可能会与Il15ra、Il12rb1/2、Cd28相互作用，增强CD8 + T细胞的抗肿瘤活性(图4H)。之前的研究表明，分泌Il12b的mDC主要来源于cDC1，NK细胞可通过表达Xcl1与cDC1交流，募集cDC1趋向肿瘤细胞，而CD39i可通过增加肿瘤中的NK细胞来增强这一作用。总体而言，CD39i加强了NK细胞的浸润从而募集了更多的cDC1靶向肿瘤, cDC1通过表达Il15、Il12b、Cd80和Cd86来激活周期CD8 + T细胞，从而达到抗肿瘤作用(图4I)。
Result5 NK细胞的衰竭逆转了CD39i在体内的抗肿瘤作用
为了验证CD39i对BC的潜在抑制机制，作者再次构建了小鼠皮下肿瘤模型，并将小鼠随机分为四组，分别用同型对照抗体CD39i、aNK1.1和CD39i+aNK1.1.1处理（图5A-C)。与对照组相比，CD39i显著抑制了肿瘤生长并提高了小鼠的总体存活率（P<0.0001），但在NK细胞缺失的小鼠中，CD39i的作用被显著逆转（P<0.001）。此外，我们发现CD39i增加了对照小鼠中肿瘤浸润的cDC1的比例（图5D）以及肿瘤Xcl1蛋白水平，但在NK细胞缺失的小鼠中没有表现出这一现象。上述结果表明，NK细胞是CD39i发挥抗肿瘤作用的关键。
为了分析Batf3−/−cdc1缺失对肿瘤微环境和CD39i疗效的影响，作者对经POM-1或PBS处理的WT和Batf3−/−小鼠进行了单细胞测序，所有细胞被聚集成10个cluster，包括：髓系细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、树突状细胞(DCs)、NK细胞、肥大细胞、Ctsk+细胞、基质细胞和上皮细胞(图6A,B)。作者发现CD39i引起了cDC1显著富集和扩增，而这种效应在Batf3−/−模型中被完全阻断(图6C,D)。值得注意的是，在Batf3−/−小鼠中mDC/cDC2比值增加，推测Batf3−/−可能会促进cDC2的成熟。
作者利用Marker基因，进一步将以上样本的淋巴细胞细分为CD4-C01-Tcm、CD4C02-Th、CD4-C03-Th-PD1、CD4-C04-Th17、CD4-C05-Treg、CD8-C01TRM、CD8-C02-Ifit、CD8-C03-Tex、CD8-C04-Tex、cd8 - c05 - cycle、NK-C01、NK-C02 - c02、NK-C03-Gzmf、NK-C04、nk - c05 - cycle 15个簇(图6F)。发现CD39i处理显著增加了增殖CD8 + T细胞和5种亚型NK细胞的比例，也提高了Batf3−/−cDC1缺陷小鼠中NK细胞数量(图6G)。
Result6 以CD39i为基础的联合治疗研究
体内实验表明，虽然单独应用CD39i或aPD-L1抗体治疗小鼠，对其皮下肿瘤模型的生长和小鼠的存活率具有相似的治疗效果，但联合CD39i和aPD-L1共同治疗并无产生协同作用(图7A-C)。通过流式细胞术分析，我们发现CD39i处理显著减少了前体耗竭T细胞的数量，而aPD-1被认为增强了前体耗竭T细胞的扩增，这可能削弱了它们协同作用。
接下来，作者尝试了CD39i、aPD1和CIS不同的组合策略。如图7D-F所示，在联合策略中，CD39i + CIS和aPD1 + CIS在抑制肿瘤生长和改善预后方面具有显著的协同作用。为进一步探讨CD39i与CIS联合的协同作用机制，作者应用流式细胞术分析不同计剂量的顺铂与CD39i的协同效果。作者发现剂量≥3 mg/kg 的顺铂在增加肿瘤中cDC1的比例方面存在协同作用，但3 mg/kg和4 mg/kg顺铂的效果相同。进一步，我们发现3 mg/kg的顺铂与CD39i在增加肿瘤浸润cDC1的比例方面具有协同作用(图7G)。
考虑到顺铂会引起肿瘤细胞死亡释放大量的ATP，而使用CD39i可以抑制细胞外的退化ATP，作者推测两者结合的方案可能会进一步增加ATP在肿瘤微环境的积累，产生更强的抗肿瘤效应。CD39i或CD39i与aPD-1联合可作为化疗后的后续治疗。
研究结论
单细胞测序技术显著提高了我们对膀胱癌（BC）基因图谱和分子特征的理解。作者通过单细胞转录组分析确定了CD39是BC的潜在治疗靶点。在皮下肿瘤模型和原位膀胱癌模型中，聚氧化锡酸钠（CD39i）对CD39的抑制能够限制BC的生长并提高患病小鼠的总体存活率。通过单细胞RNA测序，作者发现CD39i介导肿瘤微环境发生了变化，CD39i增加了肿瘤内NK细胞、cDC1和CD8+T细胞的比例，并降低了Treg丰度。而NK细胞耗竭模型和cDC1缺陷模型均阻断了CD39i对肿瘤微环境的重编程，这意味着NK细胞是CD39i发挥抗肿瘤作用的关键。随后作者开展了以CD39i为基础的联合治疗，发现CD39i+顺铂的联合治疗能产生协同效应，但CD39i+抗PD-L1没有显示出协同效应。本研究揭示了CD39是BD肿瘤微环境的作用靶点，基于CD39i的联合治疗方案为膀胱癌的治疗提供了新思路。
详细技术请访问欧易生物官网
⬇
百度搜索欧易生物（oebiotech）
⬇
了解更多多组学技术
（单细胞转录组测序实验和分析等）
长按扫码
咨询欧易生物技术工程师
猜你想看
2、Nature 文章分享会 | 解密课题研究思路设计与发文经验
3、项目文章 | 单细胞转录组测序助力解析胶质母细胞瘤模型中EGFR可重复编程的替莫唑酰胺耐受细胞的特性
4、New Phytol | 北京农学院姚允聪团队再发miRNA调控苹果花青苷机制成果
本文系欧易生物原创
转载请注明本文转自欧易生物
