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项目文章 | 单细胞测序揭示人胎盘内皮细胞及滋养细胞的异质性和分化

2022年12月25日,同济大学附属第一妇婴保健院王凯教授团队在cells(IF:7.666)在线发表了题为“Human Placental Endothelial Cell and T rophoblast Heterogeneity and Differentiation Revealed by Single-Cell RNA Sequencing”的研究论文。该研究揭示了胎盘细胞的复杂性,并展示了妊娠早期胎盘内皮细胞和滋养细胞分化的转录网络和信号通路,这将为未来人类胎盘发育的研究提供资源。

期刊:Cells

影响因子:7.666

发表年月:2022.12.25

材料:妊娠6-16周的选择性终止妊娠中采集11份健康胎盘样本

方法:10×Genomics scRNA-seq

研究背景

胎盘的正常生长发育对胎儿和产妇的健康至关重要,胎盘功能障碍可导致严重的妊娠并发症,如子痫前期、宫内生长受限、胎盘增生。出于伦理方面的考虑,人类胎盘发育的研究具有挑战性,近年来新技术的出现大大提高了人们的认识,增强了对胎盘发育的遗传和表观遗传调控的理解。最近的研究研究创建了正常和病理条件下人类胎盘转录组的图谱。然而,很少有人对人类胎盘内皮细胞(ECs)的分子特征和异质性进行识别和分析,因此,在胎盘的研究中仍有更多的细节有待完善。

研究结果

Result1 正常人类妊娠早期和中期胎盘的单细胞转录组分析

作者从胎龄6-16周选择性终止妊娠中收集了11份健康的胎盘绒毛样本,进行单细胞测序(图1A),经过质控后,共获得52,179个数据。降维聚类后,共获得8个Cluster,包括滋养细胞 (EVTs、SCTs、VCTs)、巨噬细胞、霍夫鲍尔细胞、红细胞、成纤维细胞和内皮细胞(图1B,C)。

通过对每个发育阶段每种细胞类型的转录组模式进行分层聚类分析(图1D),作者发现大多数细胞类型的转录组表型在妊娠6至7周之间以及妊娠8至9周后的样本之间相似,这意味着8 ~ 9孕周可能是妊娠早期胎盘细胞基因表达谱变化的关键时间点。

图1 | 胎龄6-16周人胎盘样本的单细胞图谱

Result2 人胎盘中不同内皮细胞簇的鉴定和特征

作者通过对内皮细胞亚型进行聚类分析,获得了三个主要的EC聚类(Endo-1,-2和-3)(图2A),每个聚类都有其代表性标记(图2B),并且发现三种细胞簇的比例有所不同(图2C)。

通过对三个细胞簇的差异基因(DEGs)分析发现(图2D,E),Endo-2可能是胎盘局部血管祖细胞或未成熟的内皮细胞;Endo-1可能是一组在妊娠早期经历内皮增殖和血管形成的细胞;Endo-是孕中期的主要细胞类型,表现出更加分化和成熟的血管内皮特征。

拟时序和RNA velocity分析显示分化较低的一侧主要由Endo-2组成,而分化较多的一侧主要由Endo -1和Endo -3占据(图2I、H),并且Endo-2是三个分化轨迹的根源:自我更新、分化为Endo-1和Endo-3(图2J),确定Endo-1细胞也表现出向Endo -3的方向和数量。这些数据进一步支持了Endo-2作为胎盘血管祖细胞的分类。

图2 | 孕早期和孕中期胎盘内皮细胞亚型分析

Result3不同胎盘内皮细胞群的代谢转录组特征

通过GSVA分析发现,三个EC簇表现出不同的代谢基因特征(图3A-E)。Endo-2中,参与糖酵解的基因上调(图3A),脂质代谢基因在三种内皮细胞簇中的分布不明确(图3B)。Endo-1中大部分参与TCA代谢的基因均升高(图3C),在妊娠早期通过内皮细胞分化和增殖的Endo-1细胞可能依赖于TCA循环和合成代谢旁通路。氧化磷酸化基因信号主要在Endo-2和Endo-1中上调(图3D),Endo-3作为孕中期主要的EC簇,主要进行糖酵解代谢而不是氧化糖代谢。综上所述,这些观察结果表明胎盘血管内皮细胞的代谢需求是亚型或阶段依赖的。

图3 | 胎盘内皮细胞的代谢异质性和转录调节异质性

Result4 转录因子在不同胎盘内皮细胞簇中的调控网络

SCENIC分析表明,Endo-1中有多个上调的转录调控因子(图3F),其他上调的转录因子及其网络也可能在人类胎盘EC早期分化和血管成熟中发挥重要作用。许多由关键内皮转录因子驱动的调控因子在Endo-3中富集,结果证明Endo-3细胞具有血管生成表型,激活一系列与血管功能相关的转录因子。

Result5 胎盘滋养层细胞亚群

作者通过单细胞测序获得16,819个数据,降维聚类后得到8个亚群,包括5个VCT亚群、2个EVT亚群和1个SCT亚群(图4A),表明在妊娠早期和中期绒毛细胞滋养层存在高度异质性。为了研究不同聚类之间的异质性,作者对各VCT亚型进行差异表达基因的热图(图4C)和GO分析(图4D),发现VCT-5和SCT的基因表达模式高度相似(图4F),VCT-5细胞中的DEGs参与上皮细胞分化(图4D),SCT高表达基因在VCT-5中也有上调。

接下来,作者分析了所有滋养层簇中合胞素相关基因集的表达水平(图4D-G),发现在孕早中期胎盘绒毛中至少存在四种功能不同的VCT亚群:具有分化潜能或已经进入分化路径的细胞包括EVT前体细胞和SCT前体细胞;未进入分化路径的细胞包括绒毛中的非增殖性VCT和增殖活跃VCT。

图4 | 人胎盘滋养层细胞的细胞亚型鉴定

Result6 人类滋养细胞祖细胞有助于EVT分化

VCT-3作为一个活跃的增殖亚群(图4E),具有VCT到EVT分化的基因表达特征(图4D和5A)。因此作者通过免疫荧光和染色(图5B-D)发现,VCT-3中的细胞充当有丝分裂活性的滋养层祖细胞,具有形成EVT生长的潜力。

图5 | 人滋养层祖细胞有助于EVT谱系

Result7 VCT与EVT的鉴别分析

作者将EVTs聚为两个亚群:EVT-1中的DEGs与锚定连接、细胞外结构组织、运动和粘附的调节以及整合素细胞表面相互作用有关(图6A)。EVT-2中的DEGs与免疫反应激活、炎症反应、mRNA代谢和翻译相关(图6B),荧光染色发现EVT-2(图6C)与VCT-3同样表达EMT相关基因(图6D)。拟时序分析结果说明(图6E-G),EVT-2可能代表了一个早期分化阶段,特征为抗炎和免疫调节,EVT标记基因低表达,并存在EMT标记。与此同时,EVT-1细胞处于成熟阶段,其运动、黏附、侵袭等功能受到调控。

转化生长因子β (TGF-β)受体信号通路和整合素介导的信号通路在EVT-1和EVT-2中富集,并且TGF-β信号受体表达从EVT-2到EVT-1逐渐升高(图6H)。几种TGF-β信号配体在EVT-1中也被上调(图6H)。这些发现说明TGF-β信号通路在EVTs分化过程中起关键作用。并且作者还发现了EVT-1、EVT-2和VCT-3之间的许多相互作用,包括与免疫调节、粘附和细胞信号通路相关的相互作用(图6J)。

图6 | EVT 亚型和拟时序分析

Result8 其他细胞类型

作者发现不同的巨噬细胞高表达基因不同,起源也不同,分别来自于胎儿和母体。为了进一步分析孕早期和孕中期免疫细胞的差异,作者探索了妊娠6-7周和14-16周的DEGs及GO功能。数据表明,霍夫鲍尔细胞经历了从妊娠早期到妊娠中期的功能成熟过,孕早期和孕中期母体巨噬细胞也表现出功能差异(图7B-E)。

通过拟时序分析来研究红系细胞的细胞状态转变过程(图7F),不同的分支代表了红系细胞的不同阶段(图7G,H)。结果表明,从妊娠早期胎盘中获得的促红细胞主要包括巨核红细胞祖细胞和早期促红细胞分化阶段的细胞。而处于状态3的细胞主要存在于妊娠6-7周的样本中,并在妊娠9周左右显著转变为状态1和状态2(图7I)。

成纤维细胞被分为四个亚群。并且被认为是高度可塑性的细胞群,在不同成纤维细胞簇之间具有不同的基因表达模式。

图7 | 免疫细胞和红系细胞分析

文章总结

作者通过单细胞测序分析,提供了妊娠6-16周人类胎盘发育的高分辨率分子图谱,分析了每种胎盘细胞类型的细胞亚型复杂性,验证了胎盘内皮细胞的异质性,以更好地了解正常胎盘内皮功能和活性的分子决定因素,并且在VCTs中鉴定了两种不同的祖细胞群,分别分化为EVTs和SCTs。这些发现促进了对调节人类胎盘发育的分子和细胞机制的理解。

DOI:https://doi.org/10.3390/cells12010087

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