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技术原理

肿瘤微生物与宿主细胞以及与肿瘤免疫微环境的互作研究已成为目前科研前沿。2022年11月，Nature杂志上发表了题为Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer的文章。作者引入靶向细菌16S rRNA保守区域的引物开发了INVADEseq（invasion–adhesion-directed expression sequencing）方法，对单细胞RNA测序进行技术改造，从而捕获宿主细胞以及微生物的两种转录组信息，揭示了肿瘤微生物与宿主细胞的相互作用。

技术流程

步骤一：获取含有微生物的肿瘤样本，建议通过2bRad-M等技术筛选含微生物的肿瘤样本。

步骤二：通过10X单细胞5'端转录组试剂，标记单个细胞及细菌（包括黏附细胞及侵入细胞的细菌）。

步骤三：含polyA引物捕获真核生物转录本，引入靶向细菌16s rRNA保守区域的引物捕获细菌转录本，分别构建基因表达文库GEX和16S rRNA基因文库。

步骤四：分别针对GEX和16s数据运行cellranger，获取有效Barcode等信息，针对16s数据的进行Reads过滤后采用Pathseq软件比对，并针对配对的GEX中有效barcode信息取交集，输出交集细胞中的微生物-基因矩阵用于下游分析。

Nature肿瘤微生物文章内容解读

肿瘤相关微生物群中的细菌在癌症的发展、转移、免疫监视和化疗抗性方面有作用。瘤内微生物群的空间分布和特定的宿主-微生物细胞相互作用是否影响肿瘤微环境（TME）内的不同功能能力，在很大程度上是未知的。文章通过对口腔鳞状细胞癌和结直肠癌应用原位空间探测技术和单细胞RNA测序，揭示了空间、细胞和分子的宿主-微生物相互作用。

首先，作者对来自11位CRC患者的44块肿瘤组织进行了16S rDNA测序（欧易技术2bRAD-M可以得到同样的分析结果），从属水平和门水平鉴定了瘤内微生物组成情况。进一步使用RNAscope-FISH技术，作者确认了微生物（如具核梭杆菌等）空间分布的非均匀性。上述结果提示，有部分肿瘤患者的肿瘤微生物组的分布不均匀。

为了进一步确认瘤内微生物的空间分布情况，接下来，作者使用10x Visium空间转录组平台（欧易可提供技术平台）对一个OSCC样本和一个CRC样本进行了检测，并利用RNAscope-FISH技术对部分结果进行了验证。通过GATK pathseq分析算法（欧易已推出分析方法），作者发现在OSCC和CRC样本中，分别有28%和46%的捕获点检测到了细菌的转录本。在OSCC中，微单胞菌属、嗜胨杆菌属和梭杆菌属是主要的属；在CRC中，梭杆菌属和拟杆菌属是主要的属。

肿瘤内细菌分布具有空间异质性

由于瘤内微生物组的分布具有异质性特征，因此，作者进一步探究了细菌的空间分布特征是否与TME有关。作者发现，细菌富集的区域磷酸化的ERK1和ERK2表达水平更高，这表明宿主细胞可能通过激活MAPK信号通路来抵抗瘤内细菌。在OSCC样本中细菌富集的区域PD-1的表达更高，表明细菌富集区域对T细胞具有一定的排挤效应。在OSCC和CRC的肿瘤上皮区域中，与细菌信号呈阴性的区域相比，细菌富集的区域血管化程度较低，增殖性亦较低。

微生物空间分布异质性与TME内的不同功能相关

为了探究肿瘤微生物-宿主细胞间的互作以及互作关系对宿主细胞转录组的影响，作者在10x genomics单细胞转录组测序技术的基础上，通过改进与磁珠相连的引物进一步开发了INVADEseq技术（具体见上）。

随后，作者将INVADEseq技术应用于7名OSCC患者的新鲜肿瘤组织，以探究肿瘤细菌-宿主细胞互作。首先，作者将肿瘤组成分离成单细胞，通过共聚焦成像法，发现OSCC患者肿瘤细胞含有粘附于细胞的细菌和胞内细菌。结合INVADEseq技术测序，结果表明，这7名OSCC患者的瘤内微生物主要是梭杆菌属和密螺旋体属，而这两个属的细菌主要存在于肿瘤的上皮细胞以及一类源自单核细胞的巨噬细胞。

INVADEseq技术捕获单细胞内微生物

接着，作者通过比较存在梭杆菌属和密螺旋体属的上皮细胞和未检测到细菌信号的上皮细胞的表达谱，探究了这两类瘤内微生物对上皮细胞的影响。GSEA分析结果显示，存在细菌的细胞IFN和JAK-STAT信号通路显著上调。而在巨噬细胞中，存在细菌的巨噬细胞其与免疫反应和白介素生成的基因以及一系列的趋化因子表达上调。

细胞相关的瘤内细菌对宿主单细胞的转录组学的影响

最后，作者评估了瘤内优势微生物具核梭杆菌和上皮细胞、免疫细胞间的直接互作。基于CRC上皮细胞球状体与具核梭杆菌进行共培养以及nCounter平台将含有具核梭杆菌的球状体分离出来进行了转录组发现，具核梭杆菌或可影响CRC上皮细胞的基因表达，促进其对周围环境的侵袭。

综上，该研究表明肿瘤患者瘤内微生物的分布并非是随机的，并且其分布特征与TME具有紧密的联系。未来值得在更多的癌种中进一步探究微生物的空间特征与肿瘤发生发展的关系。

基于INVADEseq技术改造加pathseq分析方法，欧易可实现分析内容如下（参考 Cancer Cell, 2022的例图）：

1）分析哪些细胞类型会有胞内菌的存在，及不同细胞类型微生物分布的差异；

2）从样本或分组的角度，不同样本有/无细菌对细胞类型多样性的影响，不同样本细菌富集的差异性等；

3） 结合单细胞分析细胞类型与微生物富集的相关性，在不同细胞类型中，细菌对细胞通路富集、信号转导、细胞功能的影响等；

4） 针对微生物富集的特定亚群，预测亚群与生存时间的关系（需要TCGA数据）。


 

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参考文献：

Galeano Niño, J.L., Wu, H., LaCourse, K.D. et al. Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer. Nature 611, 810–817 (2022). 

Ghaddar B, Biswas A, Harris C, et al. Tumor microbiome links cellular programs and immunity in pancreatic cancer[J]. Cancer Cell, 2022, 40(10): 1240-1253. e5

关于欧易生物

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