前言

欧易生物单细胞测序文章大爆发，本月第二篇单细胞测序客户文章来啦。上周为大家解读了单细胞测序在膀胱癌中的客户文章案例，这次一起来学习单细胞测序如何解析磨玻璃结节肺腺癌（GGN-ADC）的特性。

10月6日，复旦大学附属中山医院胸外科王群教授团队在Cell Discovery杂志（IF：6.255）发表了题为“Single-cell transcriptome atlas of lung adenocarcinoma featured with ground glass nodules”的研究论文。该研究利用高通量单细胞转录组测序比较了磨玻璃结节肺腺癌（GGN-ADC，lung adenocarcinoma featured with ground glass nodules）和实性肺腺癌（SADC，solid adenocarcinoma）肿瘤微环境图谱的异同点，解析了GGN-ADCs能够保持稳定并有良好预后的可能原因。王群教授和詹成博士为本篇文章的通讯作者，卢涛、杨晓冬和时雨博士为共同第一作者。该篇文章中scRNA-seq实验和分析相关工作由欧易生物完成。

研究背景

磨玻璃结节肺腺癌（GGN-ADC）是肺腺癌的一种早期类型，占肺癌门诊病人的绝大多数，一般状态稳定，具有低度恶性潜能和预后良好的特点。尽管GGNs具有生长缓慢的特点，其相关的分子机制仍不清楚。因此，探索GGNs的特征对于理解肺癌发生发展的机制非常有帮助。单细胞转录组测序技术目前在肿瘤领域中取得了广泛的应用，该技术可以在单个细胞水平上对转录组进行高通量测序分析，获得单个细胞内基因的表达情况，揭示细胞间的异质性。本研究利用高通量单细胞转录组测序，全面解析了GGN-ADC肿瘤微环境图谱特征。

研究内容

作者选取GGN-ADC和SADC组病人各5例进行10x Genomics单细胞转录组测序，结果共获得60,459 个细胞的表达谱数据，成功鉴定出肿瘤细胞、内皮细胞、T细胞等9种细胞类型。作者对GGN-ADC微环境细胞基因表达特征进行了深入探讨。如发现GGN-ADC 组肿瘤细胞下调了细胞增殖相关的基因，成纤维细胞表达较低水平的胶原，免疫细胞则更多的处在激活状态。此外，作者通过FACS分选了肿瘤细胞、CD4+T和CD8+T细胞，进一步通过qPCR方法验证了GGN-ADC相关分子的表达特征。

研究结果

1. GGN-ADC 和 SADC细胞类型鉴定

图1 GGN-ADC and SADC单细胞图谱

通过降维聚类，作者将60,459个细胞聚类为13个cluster共9个细胞类型。通过已知经典marker基因的表达，成功鉴定出肿瘤细胞和肿瘤微环境细胞（成纤维细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、NK和髓系细胞等）。接下来，作者对GGN-ADC中肿瘤细胞和肿瘤微环境细胞的表达谱特征进行了进一步的挖掘。

2. GGN-ADC组肿瘤细胞基因表达特征分析

基于EPCAM的表达和CNV拷贝数变异分析，作者推断大部分EPCAM阳性细胞可能是肿瘤细胞（Fig. 2a-b）。对肿瘤细胞做进一步的降维聚类发现，GGN-ADC组病人肿瘤细胞主要分布于Clusters 0, 2, 9, 11和12，几个病人之间在cluster的分布没有明显差异。相反，SADC组病人的肿瘤细胞分析具有明显的cluster偏向性，表明SADC组病人间肿瘤细胞可能具有更强的异质性特征(Fig. 2d)。GSVA结果发现，GGN-ADC组下调了细胞周期、NF-κB信号通路和Toll样受体等肿瘤相关基因的表达（Fig. 2k）。SCENIC分析结果发现，SADC组肿瘤细胞与增殖和免疫激活相关基因EGR1表达上调，抑癌基因KLF6则表达下调。

图2 GGN-ADC组肿瘤细胞异质性异质性特征和表达谱差异分析

3. GGN-ADC组内皮细胞表达特征分析

图3 GGN-ADC组内皮细胞亚群分析和差异分析

作者对内皮细胞进一步降维聚类，将内皮细胞分为血管内皮、淋巴内皮、肿瘤内皮和正常内皮这四类。GSVA结果发现，SADC组内皮细胞上调了血管生成相关基因的表达，富集了HIF-1和VEGF这些与血管生成相关的信号通路。此外，GGN-ADC组内皮细胞下调血管生成相关基因 MMP2 和 HSPG2，表明 GGN-ADC 组内皮细胞的血管生成能力要弱于SADC组。SCENIC分析结果发现，GGN-ADC下调了促癌细胞的生长、侵袭的调控子 HOXD9 的表达(Fig. 3h)。

接下来，作者分别对成纤维细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞和肥大细胞几个角度分别探究了 GGN-ADC 组拥有良好预后的可能原因。如发现在 GGN-ADC 组中，成纤维细胞表达较低水平的胶原，免疫细胞则更活跃。

4. qPCR验证基因的表达差异

图4 GGN-ADC组内皮细胞亚群分析和差异分析

作者通过流式分选，分选出肿瘤细胞、CD4T和CD8T细胞，对scRNA-seq得到的差异基因进行qPCR验证，结果发现JUN、SFN、HSPB1和CD47在癌细胞中的表达水平及KLRB1、CD48、GZMK和LY6E在CD8T细胞中的表达水平与scRNA-seq结果一致。

特别致谢

感谢欧易生物巴永兵和陆瑶在分析中提供的帮助。

欧易生物单细胞事业部简介

欧易生物是国内少数具备10x Genomics和BD Rhapsody™单细胞测序双平台的机构之一，在医学和农林方向提供专业的单细胞建库测序及分析服务，包括5’端和3’端基因表达分析、免疫组库分析（TCR/BCR）、 ATAC分析和表面蛋白分析等。

欧易生物单细胞平台具有丰富的项目处理经验，每年成功处理单细胞样本上千例；专业的售后团队，数十位生信专家和研发工程师为您的项目保驾护航；资深的技术支持人员，优化课题设计，解读数据，让客户感受有“温度的”全面服务。

END