低深度重测序（LcWGS）

全基因组低深度重测序（low-coverage whole-genome sequencing, LcWGS）是继简化基因组测序之后新一代低测序成本的标记开发方法。一般认为其测序深度在1×以下，该策略首先对群体中所有个体进行全基因组低深度重测序和变异查找，之后根据SNP位点间的连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）对缺失基因型进行推断和基因型填充（genotypeimputation），最终获取大规模样本全基因组水平的高密度遗传标记。

基因型填充是根据参考面板（reference panels）中的单体型和基因型对目标样本中缺失基因型的估计填充过程，可有效增加单核苷酸多态性（SNPs）密度，其示意图如下：

△  S1和S2代表样品，£代表缺失基因型，A、T、C、G代表已知基因型

技术比较

目前高通量SNP检测方法主要包括全基因组重测序（WGS）、SNP芯片、简化基因组测序等。其中全基因组重测序理论上能检测基因组范围的所有变异位点，但是测序成本高昂；SNP芯片检测标记数量有限、只能检测已有突变，目前商业化的SNP芯片只包含部分物种；简化基因组测序技术相较于SNP芯片，检测位点更多且不受物种限制，但只能检测基因组2%左右的变异位点。

低深度重测序技术可以减少测序数据量降低测序成本，通过基因型填充得到全基因组范围内的高密度SNP，对于全基因组关联分析（GWAS）和基因组选择（GS）而言，低深度重测序技术可以满足它们高SNP密度和大样本量的需求，性价比更高。

全基因组重测序、SNP芯片、简化基因组测序和低深度重测序技术比较如下：

技术特色

物种丰富

18物种已有panel，其他物种可定制panel。参考面板库链接为：

http://gong_lab.hzau.edu.cn/Plant_imputeD-B/#!/

http://gong_lab.hzau.edu.cn/Animal_ImputeDB/#!/

△已有panel物种图

基因型填充准确度高

评估了猪（ P i g ）、牛（ C a t t l e ）、绵羊（ S h e e p ）、水稻（Rice）、油菜（Oilseed rape）5个物种SNP填充的准确率，随着测序深度的增加，SNP填充准确率提高，在1X测序深度时，平均准确率大95.9%，其中在0.3×测序深度下，水稻基因型填充的准确率达到98.2%，绵羊基因型填充的准确率达到97.9%。

△  基因型填充准确率图

横坐标代表不同测序深度，纵坐标代表基因型填充的准确率，

不同颜色折线代表不同物种，“panel_数字”数字代表该物种panel中包含的个体数

辅助分子育种

助力全基因组关联分析和全基因组选择研究

服务优势

分析流程

应用方向：全基因组关联分析

 Population genetics of the coral Acropora millepora: Toward genomic prediction of bleaching

鹿角珊瑚基因组与群体重测序分析

发表期刊：Science

研究背景

作者首先对鹿角珊瑚进行基因组de novo测序，得到染色体水平的高质量基因组。然后在大堡礁12个珊瑚礁上采集了241个体进行全基因重测序（48个体的高深度重测序＞20×和193个体的低深度重测序，平均1.5x），发现鹿角珊瑚的种群结构很小。通过对基因组的扫描发现热休克共伴侣sacsin中存在长期平衡选择的特征。之后对213个样本的视觉白化得分性状进行了全基因组关联分析，发现白化性状由多基因控制，最后构建了白化性状的多基因评分（GPS）预测模型，这些结果为以基因组学为基础的珊瑚保护策略奠定了基础。

主要结果

1．对成年的鹿角珊瑚个体分别进行了80x 的PacBio和75x 的10X Chromium平台测序，通过生物信息学分析组装了染色体级别的鹿角珊瑚基因组，大小为475Mb，scaffold N50为19.8Mb，BUSCO评估达到了96%，注释28,188个基因。

2．基于来在12个大堡礁的48个样本的高深度重测序（平均＞20×）数据，获得了680万个SNPs，基于PCA分析、群体结构和群体历史分析、核苷酸多样性（π）推测这些鹿角珊瑚群体可能存在较高的关联，群体多样性较低。

3． 基于44个鹿角珊瑚的高深度重测序数据构建单倍型参考面板，并填充193个低深度重测序样本（平均深度1.5x），用34个高深度重测序样本（平均深度100x）评估SNP填充结果的准确性，发现最小等位基因频率大于0.05和基因型概率大于95%的SNP位点准确性能达到94%。经过滤表型缺失个体、个体亲缘关系远个体等数据，保留213样本进行后续GWAS分析。

4．视觉白化得分的GWAS结果峰值出现在13号染色体的两个基因和14号染色体的3个基因，其中有苹果酸合酶，与珊瑚的应急反应有关。

5．GWAS结果显示珊瑚白化是由多基因控制，难以鉴定具体位点。因此，作者构建了多基因评分模型（PGS，或称育种值），并评估了PGS的预测准确性，模型对珊瑚样本视觉白化得分这一表型变异的解释率达到了62%左右。

参考文献

Fuller, Zachary L et al. “Population genetics of the coral Acropora millepora: Toward genomic prediction of bleaching.” Science (New York, N.Y.) vol. 369,6501 (2020): eaba4674. doi:10.1126/science.aba4674

常见问题

1.LcWGS能做哪些物种？原因是？

基因型填充是根据参考面板中的单体型和基因型对目标样本中缺失基因型的估计填充过程。因此，有参考面板即panel的物种才能进行低深度重测序和SNP填充，目前我们借助华中农业大学信息学院生物信息团队构建的panel进行填充，因此只能进行11种动物和7种植物的低深度重测序，如果客户有高深度重测序的样品，也可以构建新的panel用于基因型填充。

2.LcWGS测序深度如何选择？

SNP填充的准确性受多个因素影响，包括panel质量、被填充样本与panel样本的亲缘关系、填充软件以及物种基因组质量等等，结合已发表文献和公司经验，建议测序深度0.5×以上，项目开启前可以进一步与我们沟通，我们会结合已有经验给出合理建议。

3.LcWGS相比芯片和简化基因组数据来说，有何优势？在什么情况下选择该技术？

LcWGS相比芯片：首先目前约有30种公开信息的农业动物商业化SNP芯片，密度在3-700K之间，对于大多数物种而言没有高质量的芯片可用；其次芯片只能检测固有位点，不能检测新位点，已有芯片很可能不适用于客户正在研究的品种；最后芯片检测SNP密度不足，使得全基因组选择对LD的依赖性强。lcWGS相较与芯片检测的位点更多，更有利于全基因组关联分析及全基因组选择。

LcWGS相比简化基因组：首先lcWGS数据在基因组上分布更均匀；其次lcWGS数据对基因组的覆盖度更高，数据测试发现，0.1×深度下，对基因组的覆盖度可达到6%-8%，更有利于GWAS分析及全基因组选择分析。

LcWGS本质上还是重测序，只是测序深度低一般在1×以下，理论上可以用于重测序的所有应用方向，如群体进化/遗传分析领域、GWAS分析领域及全基因组选择领域等。LcWGS能够通过减少测序数据量降低成本，通过基因型填充得到全基因组范围内的SNP，对于SNP密度要求高、样本数量要求多的全基因组关联分析和基因组选择而言，低深度重测序技术有明显的优势。