2025年4月30日，中国科学院神经科学研究所杜久林研究员团队，在Cell 在线发表了题为“Neural-activity-regulated and glia-mediated control of brain lymphatic development”的论文。本研究通过单细胞测序技术发现slc6a11b+放射状星形胶质细胞（RAs）可以分泌Vegfc来驱动脑膜淋巴内皮细胞（muLEC）发育，此过程受到神经活动的调节，并采用条件性基因编辑和活体钙成像等实验方法多维度解析RAs的功能，揭示了神经活动和RAs在淋巴系统发育中的作用，为脑淋巴功能障碍的治疗提供新的靶点。欧易生物提供了单细胞转录组的测序工作。

神经系统能够通过特定的解剖学机制在生理和病理条件下调控免疫反应，但神经系统是否调控免疫系统的发育以及具体的机制尚不清楚。已有研究表明软脑膜淋巴内皮细胞muLECs的发育依赖于Vegfc-Vegfr3信号通路，并参与大脑内代谢废物的清除，在维持脑部稳态和免疫功能中发挥重要作用。因此Vegfc的来源细胞，神经活动是否影响muLECs的发育的机制需要我们进一步研究，为开发更有效的脑淋巴功能障碍治疗策略提供理论依据。

本研究通过神经活动调控实验揭示了神经活动调节斑马鱼muLEC的发育，并通过单细胞测序发现Vegfc主要来源于slc6a11b+ RAs，并采用条件性基因编辑和活体钙成像等实验方法多维度解析RAs的功能，并发现该细胞与muLEC直接接触。研究还结合活体钙成像、眼去除、药物抑制等多种实验方法揭示了slc6a11b+ RAs的活动和Vegfc表达与神经活动密切相关，并且神经活动通过调节Vegfc的表达影响muLECs的发育。

1. 神经活动调节斑马鱼muLEC发育

作者为了研究muLEC的发育动力学，构建转基因斑马鱼系，发现muLECs在中脑视神经顶盖（OT）的体细胞和纤维区域之间的边界表面形成一个环，并逐渐覆盖OT神经膜的表面（图1A和B），作者通过对整个大脑的神经活动进行药理学抑制，发现丁卡因有效抑制muLEC环的形成，并显著减少OT表面的muLECs数量（图1C~G）；OT区是视觉处理的中枢，因此作者通过眼去除，减少视觉刺激实验发现，视觉输入的减少会显著减少OT表面的muLECs数量（图1H~P）；作者还通过对斑马鱼幼鱼进行了电刺激（ES），提高神经活动，发现接受处理的斑马鱼muLECs数量增加（图1Q和R）。综上所述，这些结果表明神经活动可以调节muLECs的发育。

图1 神经活动调节斑马鱼的muLEC发育

2. slc6a11b+ RAs是脑内Vegfc的主要来源

Vegfc和Vegfd是两种分泌蛋白，在脊椎动物的淋巴管发育中起重要作用，作者通过对三个时间阶段的斑马鱼全脑进行了单细胞测序，发现RAs是主要表达Vegfc和Vegfd的细胞类型（图2A和B）；通过构建KI敲入斑马鱼系，发现Vegfc+ RAs主要分布在大脑中，其突起直接靶向脉络膜血管丛（CVP）并延伸至脑表面，与muLECs直接接触（图2C~E）；通过单细胞RAs的进一步亚型分析以及原位杂交技术，发现并证实，slc6a11b+ RAs是脑内Vegfc和Vegfd的主要来源，且表现出与Vegfc+ RAs相同的形态，直接与muLECs接触（图2F~K）。综上所述，这些结果表明slc6a11b+ RAs通过Vegfc对muLECs发育进行调控。

图2 slc6a11b+ RAs是脑内Vegfc/Vegfd的主要来源

3. slc6a11b+ RAs通过Vegfc-Vegfr3信号通路对muLEC的发育至关重要

作者深入了解slc6a11b+ RAs是否调节muLEC的发育。首先，作者用甲硝唑（MTZ）对slc6a11b+ RAs进行了功能缺失实验，发现MTZ处理的斑马鱼muLEC发育被明显抑制，muLEC环路无法形成和muLEC数量显著减少（图3A~C）；之后作者发现阻断Vegfc-Vegfr3通路阻断了muLECs的发育，过表达slc6a11b+ RAs中的Vegfc，会增强muLECs的发育（图3D和E）。接下来，作者在slc6a11b+ RAs和pdgfra+成纤维细胞中特异性地进行了条件敲除和过表达Vegfc，发现slc6a11b+ RAs在决定muLEC发育中起主要作用（图3F~J）。这些结果表明slc6a11b+ RAs通过Vegfc-Vegfr3信号通路对muLEC的发育至关重要。

图3 slc6a11b+ RAs表达的Vegfc对muLEC的发育至关重要

4. slc6a11b+ RAs的活性和Vegfc表达与神经活性耦联

为了研究slc6a11b+ RAs及其Vegfc是否通过神经活动参与调节muLEC的发育，作者通过双色钙成像技术发现与OT神经绒毛中的神经元纤维相似，slc6a11b+ RAs以增加的Ca²⁺活性对光刺激做出反应（图4A~D）；作者通过单侧眼去除实验，发现与同侧OT相比，对侧OT中slc6a11b+ RAs的自发Ca²⁺活性受损（图4E~H）；通过单侧眼去除实验，发现对侧眼的RAs纤维中Vegfc的表达显著降低，但slc6a11b+ RAs的数量保持不变，在阻断神经活动后，会降低Vegfc的表达（图4I~Q）。综上所述，这些发现表明神经活动的减少导致slc6a11b+ RAs中Vegfc表达的减少。

图4 slc6a11b+ RAs的活性和Vegfc表达与神经活性耦联

5. 神经活性通过slc6a11b+ RAs中表达的Vegfc调节muLEC的发育

接下来，作者研究了神经活动是否通过slc6a11b+ RAs中的Vegfc调控muLEC的发育。作者通过对slc6a11b+ RAs 条件性敲除Vegfc（Vegfc^Δslc6a11b+）的幼虫进行了神经活动影响实验（单侧眼去除和移动条），发现与Vegfc^fl/fl相比，通过影响神经活动并不能影响Vegfc^Δslc6a11b+中muLECs的数量，但是可以通过过表达slc6a11b+ RAs中Vegfc来挽救因眼去除引起的muLEC数量减少（图5）。这些结果说明神经活性通过slc6a11b+ RAs中表达的Vegfc调节muLEC的发育。

图5 神经活性通过slc6a11b+ RAs中表达的Vegfc调节muLEC的发育

6. ccbe1+成纤维细胞与slc6a11b+ RAs协同控制muLEC模式

上述结果揭示slc6a11b+ RAs通过大脑中Vegfc的表达调节muLEC的发育，而RAs位于脑实质，而muLECs位于软脑膜，作者想要了解muLECs的空间定位如何局限于脑表面？接下来，作者构建ccbe1敲除的斑马鱼，发现slc6a11b+ RAs中过表达Vegfc也无法恢复ccbe1敲除造成的muLECs的发育抑制（图6A~6C）。通过构建KI敲入斑马鱼系，发现定位于脑表面的成纤维细胞中有ccbe1表达（图6D）；之后通过表达slc6a11b+ RAs中Vegfc的成熟形式，会造成LECs在脑内的异位生长和脑实质内管腔化LECs的形成（图6E~G）。综上所述，这些结果表明，Vegfc功能的精确控制是由两种空间分离的细胞类型介导的：大脑内负责Vegfc生成的slc6a11b+ RAs和大脑表面负责Vegfc成熟的ccbe1+成纤维细胞。

图6 ccbe1+成纤维细胞与slc6a11b+ RAs协同控制muLEC模式

7. ccbe1+成纤维细胞与slc6a11b+ RAs协同控制muLEC模式

slc6a11b+ RAs将pro-Vegfc转运到脑膜，ccbe1+成纤维细胞与RAs合作，在脑实质和脑膜成纤维细胞之间的界面将pro-Vegfc转化为成熟的Vegfc（活性形式），限制muLEC的形成仅在脑表面。

图7 脑控制muLEC发育的工作模型

1. slc6a11b+RAs是大脑Vegfc的主要来源；

2. 由slc6a11b+ RAs产生的Vegfc控制muLEC的发育；

3. 神经活动通过slc6a11b+ RAs中表达的Vegfc调节muLEC的发育；

4. slc6a11b+ RAs与ccbe1+成纤维细胞协作来限制脑表面muLEC的生长。

参考文献：Li J, Liu MJ, Du WJ, et al. Neural-activity-regulated and glia-mediated control of brain lymphatic development. Cell. Published online April 22, 2025. doi:10.1016/j.cell.2025.04.008