豆科植物通过与土壤中的根瘤菌形成共生关系来获取氮素，这种共生关系对植物生长至关重要。然而，植物如何在不损害自身免疫能力的情况下维持根瘤共生状态，即如何实现对根瘤菌的耐受共生的同时保持对病原菌的免疫平衡，这一机制尚不清楚。

2025年5月6日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心王二涛团队在国际学术期刊Nature在线发表了题为“A kinase mediator of rhizobial symbiosis and immunity in Medicago”的研究论文，该研究通过酵母文库筛选发现了一种能够与结瘤因子受体激酶MtLYK3互作且相互磷酸化的胞质激酶MtLICK1/2，通过大量遗传转化等实验发现这对激酶既可以促进根瘤菌共生的建立，同时还可适度抑制植物免疫反应，从而协同放大共生信号，促进豆科植物与根瘤菌的共生关系。

细胞外信号的感知和随后的下游信号转导通常需要配体结合受体激酶和共受体激酶之间的相互转磷酸化才能实现。在豆科植物苜蓿中，已知的MtNFP和MtLYK3是结瘤因子 （Nod factor）识别的2个重要受体激酶，然而只有MtLYK3具有转导结瘤因子信号的激酶活性，推测结瘤因子受体复合体中可能有其他未知的受体激酶可以与MtLYK3互作及相互磷酸化，从而启动植物共生信号。

1. MtLICK1/2与MtLYK3互作

为了筛选新的能够激活MtLYK3的激酶蛋白，研究者以MtLYK3胞质内结构域为诱饵，筛选接种根瘤菌S. meliloti 1021的苜蓿根cDNA文库。结果筛选到了一个强互作蛋白，并命名为MtLICK1（图1b）。系统发育分析表明，MtLICK1属于一个独特的受体样激酶支系，在丛枝菌根共生植物中保守。MtLICK2和MtLICK3是MtLICK1的同源蛋白，进一步通过Y2H检测了这2个同源蛋白是否也与MtLYK3互作，结果发现MtLICK2也与MtLYK3互作，此外还发现MtLICK1/2与MtNFP、MtDMI2及自身间均不互作，说明MtLICK1/2与MtLYK3间的互作是特异的。荧光共定位及CoIP对互作进行了验证确认，同时还观察到MtLICK1/2与MtLYK3在细胞质膜处形成了一个受体复合体（图1d，e）。

图1. MtLYK3与MtLICK1/2相互作用

2. MtLICK1/2调控豆科植物根瘤菌共生

为了确定MtLICK1/2是否在植物-根瘤菌共生中发挥作用，首先进行了基因表达量检测，发现结瘤因子处理或者接种根瘤菌都显著增强了MtLICK1/2的转录水平；通过蛋白组织定位检测（GUS）发现pMtLICK1：GUS和pMtLICK2：GUS主要在根毛和毛状根尖中表达；接种根瘤菌后，它们定位于结瘤原基和成熟结瘤的感染区，与pMtLYK3：GUS相似。

接着，研究者构建了Mtlick1、Mtlick2、Mtlick1/2突变体，在接种根瘤菌S. meliloti 1021后，观察到突变体植株结瘤显著减少，其中Mtlick1/2从未形成粉色具有固氮功能的根瘤，在接种21天或28天时仅有少量小突起，且没有固氮作用；在Mtlick2突变体中通过RNAi沉默MtLICK1，发现结瘤进一步减少；基因回补后，结瘤性状恢复（图2）。这些数据表明，MtLICK1和MtLICK2是根瘤菌侵染和根瘤形成的主要调节因子，在根瘤共生中功能冗余。

图2. MtLICK1和MtLICK2是根瘤菌共生所必需的

3. MtLICK1/2在结瘤因子信号转导中的作用

接下来，作者研究了MtLICK1/2是否是启动共生信号的受体激酶。首先是对共生标记基因（MtMIN、MtENOD11）的表达量进行检测，发现相比野生型，Mtlick1/2突变体中共生标记基因表达量显著下降，说明MtLICK1和MtLICK2对结瘤信号转导至关重要。接着，通过体外激酶检测试验，研究者确认了这2个蛋白均具有自磷酸化和转磷酸化活性，并且通过蛋白序列分析和氨基酸定点突变，找到了其上关键的ATP结合位点MtLICK1 (K78) 和MtLICK2 (K73)（图3a）。

4. MtLYK3激活MtLICK1/2并促进共生

通过LC-MS分析，发现MtLYK3磷酸化MtLICK1/2的激酶结构域内存在的三个磷酸化位点，分别位于ATP结合P环和激活环。模拟磷酸化的突变体（如MtLICK1^S60D、MtLICK2^S55D和MtLICK1/2^3D）表现出更高的激酶活性，并能完全恢复Mtlick1/2双突变体的结瘤能力，而模拟未磷酸化的突变体（如MtLICK1/2^3A）则降低了激酶活性和共生效果（图3b-e）。此外，结瘤因子通过激活MtLYK3来磷酸化MtLICK1/2（图3f,g），且磷酸化的MtLICK1/2与MtLYK3的相互作用减弱。研究表明，MtLYK3在根瘤共生过程中通过磷酸化激活并释放MtLICK1/2激酶，从而促进共生过程。

图3. MtLYK3磷酸化MtLICK1/2并调节根瘤菌共生

5. MtLICK1/2磷酸化并激活MtLYK3促进共生

MtLICK1/2显示出转磷酸化活性，且在MtLICK1存在的情况下，MtLYK3被强烈磷酸化。于是研究者推测MtLICK1/2可能就是长期以来一直寻找的能够磷酸化并激活MtLYK3的激酶。为验证该推测，使用重组GST-MtLICK1^WT、GSTMtLICK2^WT和激酶活性丢失的MBP-MtLYK3^K349E进行了体外磷酸化试验。如预期，MBP-MtLYK3^K349E缺乏自磷酸化活性，但可以被GST-MtLICK1^WT和GSTMtLICK2^WT转磷酸化（图4a）。MtLICK1/2具有转磷酸化活性，且在体外和体内均显著增强MtLYK3的自磷酸化和转磷酸化（图4b）。通过LC-MS分析，鉴定出MtLICK1/2磷酸化的八个位点，其中T472、T475、T480和Y483位于激酶的激活段，且T472、T475和T480对根瘤菌共生至关重要。进一步研究发现，将Y483替换为苯丙氨酸（F）后，重组的MtLYK3^Y483F缺乏激酶活性，且相比野生型，MtLYK3^Y483F未能恢复Mtlyk3-1突变体的结瘤表型及相关基因表达（图4c,d）。此外，MtLYK3^Y483F蛋白在转化后的植物中无法检测到，表明Y483可能参与调节MtLYK3的稳定性，其在共生中的具体作用尚需进一步研究。

还有1个位点是Y488，位于MtLYK3的YAQ基序内，YAQ基序在百脉根中负责维持共生和免疫。为了揭示YAQ基序中Y488位点的磷酸化在根瘤共生中的关键作用，使用针对Y488磷酸化的特异性抗体进行了体外磷酸化检测，发现Nod因子诱导的Y488磷酸化依赖于MtLICK1/2（图4e,f）。互补实验显示，MtLYK3^Y488F突变体无法有效诱导共生标记基因表达，也不能恢复结瘤表型，表明Y488磷酸化对根瘤菌共生至关重要（图4g,h）。研究还表明，MtLYK3能够磷酸化MtDMI2，而MtLYK3^Y488F突变体失去了这种能力，且模拟未磷酸化的MtDMI2突变体无法恢复结瘤，进一步证实了MtLYK3磷酸化MtDMI2对共生的必要性。

图4. MtLICK1/2磷酸化MtLYK3是根瘤菌共生所必需的

6. MtLICK1/2减弱植物免疫反应

与野生型植物相比，Mtlick1、Mtlick2及Mtlick1/2突变体在根瘤菌处理后显示出更高的MAPK激活和ROS积累（图5a-d），免疫标记基因表达量也相对更高，表明MtLICK1/2在野生型植物中抑制免疫反应。为了探索MtLICK1/2更广泛的免疫功能，研究者又用其他病原菌（Ralstonia）感染突变植株和野生型植株，结果发现野生型植株生存率明显低于Mtlick1、Mtlick2及Mtlick1/2突变体，进一步表明了MtLICK1/2在野生型植物中抑制免疫反应。研究假设结瘤因子激活的MtLICK1/2抑制植物免疫以促进共生。实验显示，同时使用结瘤因子和病原菌处理苜蓿时，野生型植物的根对青枯病菌感染更敏感。而Mtlick1、Mtlick2和Mtlick1/2双突变体对青枯病菌的敏感性较低，且结瘤因子处理对其无影响，表明结瘤因子减弱植物免疫促进共生依赖于MtLICK1/2的精细调控（图5f）。

图5. MtLICK1/2减弱植物免疫

图6 MtLICK1/2 在豆科植物与根瘤菌共生信号转导和免疫调控中的双重功能

该研究发现，细胞质类受体激酶MtLICK1/2与MtLYK3特异性相互作用，在根瘤共生过程中通过相互磷酸化激活结瘤因子受体复合物，从而启动共生信号转导。同时，该研究还揭示了MtLICK1/2在豆科植物与根瘤菌共生信号转导和免疫调控中的双重功能，拓宽了人类对共生与免疫交叉新领域的认知。

本项目中所用的苜蓿酵母cDNA文库由欧易生物构建。

分子植物卓越中心王二涛研究员为该研究的通讯作者，王二涛研究组已出站博士后王大鹏和上海中医药大学青年教师金蕊为该研究的共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金、新基石研究员项目、中国科学院基础研究青年科学家项目、中国科学院B类先导项目以及腾讯科学探索奖等基金的资助。

Doi: https://doi.org/10.1038/s41586-025-09057-0