2025年5月，中国科学院分子植物科学卓越创新中心詹帅团队在Science杂志（IF=45.8）发表题为“Functional polymorphism of CYCLE underlies the diapause variation in moths ”的研究论文，该研究谈论了一种可选择的异构体，挖掘昼夜节律蛋白CYC在鳞翅目昆虫中的滞育功能，并鉴定出一个新衍生的突变，该突变是沿着热带地区驯化产生的，从而导致家蚕滞育变异。

滞育是指通过暂停发育以应对不利季节，是昆虫常见的季节性适应策略。研究滞育变异的遗传基础，有助于理解昆虫如何快速适应环境变化以实现物种形成及扩展，并预测其在全球气候变化下的进一步适应。目前针对昆虫滞育性状多样化的分子机制，尤其是非模式物种中特定因果等位基因的作用，仍知之甚少。本研究旨在结合经典遗传学方法和高通量全基因组分析：（1）鉴定家蚕滞育变异的关键基因位点；（2）验证这些位点在其他鳞翅目物种中的类似作用。

本文通过兼性滞育与非滞育品系杂交，将主要基因位点定位到Z染色体上。采用全基因组关联分析，发现影响最大的位点位于核心时钟基因Cycle（昆虫中与脊椎动物BMAL1同源）的5’区域。作者鉴定出特异性存在于非滞育品系的1个碱基对缺失，该缺失破坏了CYC的特定异构体（CYC-C），同时保留了其他异构体（CYC-A/B）的完整拷贝。CYC-C参与调控家蚕滞育，并与多个潜在滞育调控功能模块相关，而CYC-A/B可能保留CYC作为昼夜节律基本调控组分的原始功能。且不同CYC异构体的表达受独立调控，这种功能多样性在鳞翅目多个类群中广泛存在，在与家蚕分化约1亿年前的亚洲玉米螟中验证了CYC-C对幼虫滞育的调控作用。

1. Cycle是家蚕滞育变异的主要位点

首先，作者通过兼性滞育V2菌株(JS)和非滞育V3菌株(Nistari)生成作图群体，所有杂交后代(F1)都表现出滞育表型，表明滞育性状的显性效应。F1与F2杂交产生分离群体，连锁分析确定Chr Z末端具有最大效应，表明滞育特征的强关联。

为了缩小区间，作者通过全基因组关联研究(GWAS)分析与滞育表型的相关性，跨越三个基因观察到Cyc 5′区域具有最强的富集关联特征。以上证据表明Cyc 5′区域是造成滞育和非滞育表型之间差异最可能的位点。

为了验证这一假设，作者基于CRISPR/Cas9破坏滞育菌株中的CYC。几乎所有KO突变体产下的卵在产卵后第9天正常发育并孵化，这与野生型产下的滞育卵不同，野生型产下的滞育卵发育成深紫色，并且至少2个月不孵化。结果说明CYC在家蚕滞育中起作用。

图1 家蚕滞育变异基因的鉴定

2.突变破坏非滞育株CYC的特定亚型

Cyc是脊椎动物BMAL1的昆虫同源基因，编码bHLH-PAS转录因子，该转录因子与CLOCK形成异二聚体，在中枢时钟的转录反馈环中起作用。5′端含三种完整转录产物(称为CycA、CycB和CycC)和一种未成熟形式(Cyc0)。作者通过全长转录组测序和RT-PCR实验进一步验证滞育表型最强的关联特征。

Cyc基因包含完整的96kb序列，编码区包括9个非同义变异，大多数在滞育之间（V1和V2）和非滞育株（V3）表现出一致的等位基因频率，除了在CycC的初始特异性外显子中的1个碱基对（bp）缺失，这种V3特异性缺失是导致CycC功能性破坏及非滞育表型最可能的候选者。CycA在早期发育占主导地位，而CycC的比例从蛹阶段开始增加，化蛹后第4天达到高峰，这是母代释放滞育激素（DH）诱导后代滞育的关键阶段。对三个非滞育株系和四个滞育株系的转录组数据进一步分析显示，在所有非滞育株系中CycC表达水平显著降低，这些结果支持CycC在调节滞育中的作用。

图2 导致家蚕滞育等位基因的鉴定

3.CYC通过GABAergic-CRZ-DH 信号通路调节滞育

作者将Cyc对通路影响进行了自下而上的研究，DH作用于滞育激素受体（DHR）以诱导滞育。免疫荧光分析显示，滞育表型可以在Cyc-KO突变体中被完全拯救。在KO突变体中没有观察到DHR表达的显著变化。

作者进一步研究三种Cyc同种型的挽救试验，（KO 1+CycC）在DH释放之前有效地挽救了Crz的表达，而CycA的转基因（KO 1 +CycA）或CycB（KO 1 +CycB）甚至导致进一步抑制，结果说明CYC可以通过促进GABA能信号的有效清除来调节滞育。

图3 CYC及其亚型在滞育调节中的作用

4. CycC共表达网络与滞育控制

根据转基因系的转录组数据来探索CYC及其各自同种型功能相关的基因。Cyc破坏后，有896个基因上调，626个基因下调，包括滞育相关的Hsp 70和Hsp20.4。CYC敏感的HSP基因都可以被CycC转基因完全或部分拯救，而CycA或CycB只有一部分。应用加权基因相关网络分析（WGCNA）构建了23个有生物学意义的模块，其中与CycA和CycB均显著相关的模块M2和M4，表明CycA和CycB之间的功能趋同。

研究主要集中在模块M5和M8，它们分别代表处于CycC特异性抑制和激活下的基因。M5包括两个先前报道的滞育相关基因Tret1和CatL，分别参与伴随滞育的海藻糖转运和脂质储存。通过人工筛选CycC核心共表达基因构建功能模块，发现参与OXPHOS的基因被CycC整体阻遏，表明与OXPHOS与滞育相关的的功能联系。筛选TF发现三个重点关注：（1）Pitx，一种垂体特异性TF，发现其与DH的启动子结合;（2）HoxA1，与家蚕胚胎的延迟发育有关;（3）Chchd2，一种参与OXPHOS的含有卷曲螺旋结构域的线粒体TF。

5.CYC不同亚型赋予其功能多态性

作者重建了一个CycC网络，该网络与家蚕滞育调控的已知成分有很强的相关性。除了Cyc本身，在中枢昼夜节律时钟中的15个注释基因中，有13个与CycA和CycB转基因显著相关。

BmN细胞系中的核免疫染色试验表明CYC的所有功能亚型都定位于细胞核。荧光染色显示，在蛹脑背外侧区域的顶侧，CycC转基因系存在特异性荧光信号。通过CUT&Tag分析CYC结合染色质与同种型A和C的转基因互作关系，结果发现几乎一致的染色质景观几乎不能解释蛋白互作的功能差异。

ATAC-seq数据发现与CycA和CycC的5′UTR精确匹配的两个峰。全长转录本研究表明，CycB的转录起始于CycA起始外显子，相似的转录模式提示CYC-A和CYC-B之间的功能趋同。

6.CYC的功能多样性在鳞翅目昆虫中广泛存在

作者探讨了CYC功能多态性是否在其他昆虫中也很常见。结果发现，尽管内含子长度存在相当大的差异，但CycC和CycA、B的替代结构在鳞翅目亚系的多个物种中得到保留，并在两个代表性物种中得到了实验验证：野蚕蛾和亚洲玉米螟。

结果发现CycA/B和CycC候选5′UTR和启动子区域与ATAC-seq峰完全重叠，并沿着物种形成追溯到1.1亿年前，分别在CycA和CycC的TIS附近鉴定了两个特异性motif，在所有被调查的物种中都很常见。对来自其他物种ATAC-seq数据的分析显示，在广泛的鳞翅目昆虫中，CycA和CycC的5′端周围存在两个独立的CRE，这表明了一个古老的起源。在实验室条件下通过共同功能结构域的诱变获得了Cyc-KO品系，观察到的表型支持CYC-C在控制其他鳞翅目物种滞育方面的潜力。

本研究揭示了昼夜节律蛋白CYC通过其异构体之一调控鳞翅目滞育的新功能，并鉴定出一个伴随热带驯化过程的新突变，该突变导致家蚕滞育表型变异。CYC的功能多样性在鳞翅目中广泛存在，可能调和了季节性适应的灵活性与昼夜节律基本功能的保守性。

本文针对家蚕滞育功能进行了深入研究，首先通过生成作图群体，在基因组水平结合全基因组关联分析挖掘造成滞育和非滞育表型之间差异最可能的位点，进一步结合转录组、表观组学等高通量检测技术，采用个性化WGCNA分析并构建CycC相关网络，结合鳞翅目昆虫等多物种的功能多态性研究，进一步锁定滞育的功能机制和重要性。文章整体思路清晰完整，环环相扣，值得大家参考和借鉴。

参考文献：

SR Zheng, YH, Wang, GY, Li, et al. Functional polymorphism of CYCLE underlies the diapause variation in moths[J]. Science, 2025, 388: 936.