前言

嫁接作为重要的园艺技术手段，在生产中具有广泛的应用。mRNA 作为重要的信号分子可以在接穗与砧木之间穿梭运输。对于嫁接体中 mRNA 的长距离运输分析，有助于解释嫁接体表型变化的分子机制。但如何有效鉴别异种运输的 mRNA？

2020年7月24日，中国农业大学高丽红教授和张文娜副教授作为共同通讯作者，在International Journal of Molecular Sciences杂志（IF=4.556）发表题为“Identification of Long-Distance Transmissible mRNA between Scion and Rootstock in Cucurbit Seedling Heterografts”的研究论文，该研究通过转录组测序和基因组重测序分析，首次系统研究了黄瓜-南瓜嫁接体中mRNA 的长距离运输。文章中转录组测序与重测序由欧易生物完成。

研究背景

嫁接广泛应用于多种植物的繁殖和生产，可提高生长活力以及环境适应性。已有文献证明，植物异种器官之间可以系统性的交换信号（包括水、矿物质、激素、光合同化产物、氨基酸、蛋白质和RNA），这些物质由木质部和韧皮部系统的脉管系统传递。mRNA的交换已在大量异种嫁接研究被发现，例如拟南芥和烟草、黄瓜与西瓜等。

大量mRNA通过脉管系统在不同器官间定向移动，但在不同的生长条件和发育阶段，长距离运输mRNA的数量和方向有所不同。黄瓜(Cucumis sativus )是我国主要的保护性蔬菜作物，为防止生物和非生物胁迫，黄瓜幼苗主要通过嫁接到同属葫芦科的商业南瓜(Cucurbitea moschata ) 砧木上进行栽培。然而嫁接引起的生长发育改变，特别是接穗与砧木之间的mRNA信号交换如何影响黄瓜-南瓜嫁接体对环境条件的适应和耐受性目前尚不清楚。

研究内容

在本研究中，作者开发了一个异种嫁接系统，使用黄瓜（Csa）和南瓜（Cmo）来研究接穗砧木mRNA的长距离运输。通过对转录组测序与重测序数据的分析，作者鉴定到了大量在异种嫁接葫芦科植物中长距离运输的mRNA。结合功能分析发现，长距离运输的mRNA广泛参与了各类生物、生理过程。

研究结果

1. 异种嫁接体系中可鉴定到大量的mRNA长距离运输

作者首先选用了黄瓜（Csa）和南瓜（Cmo）籽苗进行了同种嫁接和异种嫁接，共获得了4组嫁接后的幼苗（见图1A）。随后取接穗的第一子叶（包括叶柄）以及砧木的根作为样本进行后续检测（见图1E）。

图1｜嫁接组设置与取样部位

考虑到实验使用的黄瓜与南瓜的品种和参考基因组来源品种有一定差异，为避免对后续长距离运输mRNA鉴定的干扰，作者先对黄瓜与南瓜进行了重测序，并以此为基础对参考基因组进行个性化的序列调整。结合重测序及转录组测序数据，作者鉴定到大量发生交换的mRNA，以Cmo（南瓜，接穗）/Csa（黄瓜，砧木）中的黄瓜砧木样本为例，鉴定的具体步骤如下（见图2）：

（1）将转录组数据与黄瓜基因组数据进行比对；

（2）将未比对上的reads同南瓜参考基因组进行比对，保留比对上的reads；

（3）将比对上南瓜的reads和黄瓜同种嫁接后获得的转录组数据比较，保留无法完美匹配的reads；

（4）上一步的reads和同种嫁接南瓜中的reads进行比较，保留完美匹配的reads；

（5）与南瓜参考基因组CDS序列比较，获得初步的长距离运输mRNA信息（获得黄瓜中南瓜来源的mRNA）；

（6）保留在南瓜同种嫁接样本中FPKM>1的基因；

（7）上一步基因保留在三组生物学重复砧木中均表达的mRNA作为鉴定到的可长距离运输的mRNA。

最终作者发现黄瓜有3923中mRNA，南瓜有1788个mRNA可发生远程转移。

图2｜生信分析流程示意图

2. 异种嫁接后长距离运输的mRNA在黄瓜、南瓜中呈现不同的特点

两种异种嫁接共发现了3923个可以发生长距离运输的黄瓜mRNA，其中3585个（91.4%）个mRNA仅在以黄瓜为接穗时向下长距离运输，39个（0.99%）mRNA仅在黄瓜作为砧木时向上长距离运输，而299个（7.6%）mRNA发生双向长距离运输。而这一组成在南瓜mRNA长距离运输中有所改变，南瓜可长距离运输的1788个mRNA中有192个（10.7%）仅发生从下到上的长距离运输（见图3A）。进行同源性比对后发现，有部分同源mRNA在南瓜和黄瓜中有相同的移动趋势（见图3B）。

图3｜接穗与砧木间异源长距离运输的mRNA

3. 同向移动的同源与非同源mRNA功能富集结果

作者随后对图3B中同源以及非同源的同方向移动的mRNA分析进行了功能富集分析。向下移动的同源mRNA富集到了核酸结合、ATP结合、离子结合以及细胞高分子定位等GO条目（见图4A）。KEGG的富集结果显示这些mRNA在RNA转运、柠檬酸循环以及碳代谢等信号通路（见图4C）。而非同源mRNA的KEGG富集结果显示黄瓜来源的向上和向下移动的mRNA均会富集到碳代谢的相关通路，而南瓜仅向上移动的mRNA有此富集特点（见图5）。

图4｜高同源性、向下移动mRNA的GO与KEGG富集结果

图5｜非同源长距离运输mRNA的KEGG富集结果

4. 低通量实验证明长距离运输mRNA的存在

作者之后挑选了部分测序鉴定到的长距离运输的mRNA进行了RT-qPCR的验证。考虑到黄瓜与南瓜同属于葫芦科，检测某物种来源的mRNA时，需要保证引物对黄瓜来源mRNA有效扩增的同时在南瓜中扩增效率较低（见图6B）。最终作者挑选了80个mRNA进行验证，其中63个mRNA（78.75%）检测到了相同方向的运输趋势，证明前期测序获得的长距离运输的mRNA有较高的可靠性（见图6C）。

图6｜引物的物种特异性以及验证吻合度统计结果

研究结论

本文结合了转录组测序以及重测序的结果鉴定到了大量在黄瓜与南瓜异种嫁接时发生长距离运输的mRNA。功能富集结果显示在黄瓜为接穗，南瓜为砧木时，向下与向上运输的mRNA均可以富集到碳代谢相关的通路，推测黄瓜接穗来源的mRNA进入南瓜根部后促进了碳固定，而南瓜来源的向上移动的mRNA又促进了碳代谢、光合作用。这个反馈信号通路可以一定程度上解释南瓜砧木提高黄瓜产量的机制（见图7）。

图7｜接穗-砧木-接穗的环状反馈调节模式图

参考文献

Wenqian Liu, Chenggang Xiang, Xiaojun Li, et al. Identification of Long-Distance Transmissible mRNA between Scion and Rootstock in Cucurbit Seedling Heterografts. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(15): E5253