前 言

2019年8月27日，中国医学科学院药物研究所胡卓伟研究员团队在顶级期刊《Immunity》（IF：21.522）报道了在肺泡巨噬细胞中，阻碍GSK-3和A20的相互结合可以有效治疗肺纤维化。该篇文章中10x Genomics单细胞转录组测序的实验和分析工作由欧易生物完成 。下面，一起学习下这篇文章的研究思路和内容吧。

基本信息

论文题目: Targeting Degradation of the Transcription Factor C/EBPb Reduces Lung Fibrosis by Restoring Activity of the Ubiquitin-Editing Enzyme A20 in Macrophages

发表期刊： Immunity

影响因子: 21.522

作者单位: 中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室

研究背景

肺纤维化是一种由反复的肺损伤和炎症驱动的慢性和进行性疾病，目前还没有很好的治疗方案。深入了解肺纤维化的发病机制有助于发现有效的抗纤维化药物。之前有文献报道肺泡巨噬细胞和激活的肌成纤维细胞非常靠近，可以触发慢性炎症和肺纤维化。另外一方面，泛素编辑酶A20因其强大的抗炎能力和泛素化功能，引起广泛的关注。然而，在肺纤维化疾病中，A20在巨噬细胞中发挥的作用和机制仍有待于研究。

研究目的

探讨肺纤维化疾病中，A20在巨噬细胞中发挥的作用和机制，进一步寻找肺纤维化治疗的新靶点。

研究内容

1. 肺泡巨噬细胞中A20和肺纤维化的发展呈负相关

Figure 1. 肺泡巨噬细胞中A20和肺纤维化的发展呈负相关

为了确定A20在肺纤维化进展中发挥的作用，作者首先构建了小鼠肺泡巨噬细胞中A20特异过表达和沉默模型（即Tnfaip3 +/-Lyz2-cre 小鼠和Tnfaip3 F/+Lyz2-cre小鼠）（Figure 1A）。结果发现，过表达A20显著性降低了肺纤维化的一些指标（Figure 1B-1D），促进了肺的功能（Figure 1E）。

2. 肺泡巨噬细胞中A20酶功能障碍促进了肺纤维化发展

Figure 2. 肺泡巨噬细胞中提高A20的活性可以抑制促纤维化表型

作者发现模型组和对照组中A20的表达变化差别不大（Figure 2A-2B），但是模型组中A20的活性显著降低（Figure 2C）。为了探讨A20活性和肺纤维化发展的关系，作者对博莱霉素诱导的WT组和A20过表达组巨噬细胞进行单细胞测序。结果将两组细胞共分为11个cluster（Figure 2E），组间巨噬细胞区分的比较开（Figure 2F），表明两组之间表达谱差距较大。相对于WT组，作者发现促纤维化因子Arg1在过表达组中表达量显著性降低（Figure 2G-2H）。此外，临床样本也得到类似结果，A20在肺纤维化患者和正常组巨噬细胞中表达差异不大（Figure 3A），但患者巨噬细胞中A20活性较低（Figure 3A-3C）。恢复A20的活性后发现，M2型巨噬细胞marker的表达量下调（Figure 3E），M1型巨噬细胞marker的表达量升高（Figure 3F）。以上结果表明肺泡巨噬细胞中A20酶功能障碍促进了肺纤维化发展。

Figure 3. A20活性降低直接影响PF患者巨噬细胞的的促纤维化表型

3. 肺泡巨噬细胞中A20通过破坏C/EBPβ的稳态抑制促纤维化表型

Figure 4. A20通过下调C/EBPβ抑制促纤维化表型

这一部分作者探究肺泡巨噬细胞中A20的作用机制。通过质谱鉴定，作者共筛选得到176个能够和A20互作的目标蛋白（Figure 4A-4B），最终将目标聚焦在C/EBPβ（Figure 4C）。过表达A20抑制了C/EBPβ的表达（Figure 4D），体内过表达C/EBPβ促进了肺纤维化表型（Figure 4E-4G）。C/EBPβ是A20泛素化修饰的底物，这里作者发现F20通过清除K63泛素化修饰（Figure 4K），增加K48泛素化修饰链（Figure 4M），使得C/EBPβ降解。

4. GSK-3β磷酸化A20使得A20的活性受到抑制

Figure 5. GSK-3β磷酸化A20使得A20的活性受到抑制

相对于正常组，肺纤维化患者巨噬细胞中A20表现出较高的磷酸化水平（Figure 5A）。下面，作者想要知道是哪一种激酶负责AMs中A20的磷酸化。通过质谱分析，作者找到了7个目标激酶（Figure 5B），最终确定GSK-3β负责将A20磷酸化（Figure 5B-5G）。此外，临床病人中也发现，AMs中同样高表达GSK-3β，这与PF中A20的高磷酸化水平结果一致（Figure 5H-5I）。

5. 破坏GSK-3β和A20的相互作用可以有效治疗肺纤维化

Figure 6. 破坏GSK-3β和A20的相互作用可以恢复A20的活性

因为GSK-3β和A20的相互作用可以增强转录因子C/EBPβ的表达，提高促纤维化相关因子的表达，所以作者试图期望通过破坏GSK-3β和A20的相互作用治疗肺纤维化。前期报道指出，α-螺旋肽可以作为良好的药物性先导化合物。因此，作者在GSK-3β结合域上筛查得到4个α-螺旋肽（Figure 6A），其中发现PA（Peptide A）展现出和GSK-3β高度的亲和力（Figure 6B），后续作者证实PA确实可以抑制C/EBPβ的表达（Figure 6D-6H）。最后作者利用小鼠模型体内验证了该小分子多肽PA可以有效的治疗肺纤维化（Figure 7）。

Figure 7. 破坏GSK-3β和A20的相互作用可以有效治疗肺纤维化

文章结论

肺泡巨噬细胞中，GSK-3β与A20相互作用使得A20发生磷酸化，因此泛素化编辑酶A20活性受到抑制，使得其底物转录因子C/EBPβ高表达，从而促纤维化因子得到高表达，促进了肺纤维化发展。此外，作者发现小分子多肽PA，可以很好的阻止GSK-3β与A20的相互作用，缓解肺纤维化病情进程。

参考文献

DOI:https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.06.014

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