前言

长期以来, 性别一直是生命科学研究的重大命题之一。大多数脊椎动物为雌雄异体, 且在形态和生理上表现出显著的雌雄两性性别差异, 也正是这些性别差异使生命变得复杂而精彩, 以致进化生物学家认为“性别是进化生物学中问题的皇后”。

鱼类的性别决定机制具有原始性、多样性和易变性，存在从雌雄同体到雌雄异体的各种性别类型，性逆转在鱼类也是较为常见的现象。鱼类性别发育是以遗传基因为基础，并受到自身内分泌调节和外界环境的影响，是三者相互作用的结果。因此，鱼类性别决定的复杂性给研究带来了难度。

目前用于寻找性别特异的DNA片段的方式主要有两种：

1）从发表的文献或者数据库中搜索性别决定基因，通过序列比对寻找同源序列，设计兼并引物，在目的物种中采用PCR扩增该基因的同源片段或者直接通过DNA杂交的方法，看其在目的物种是否表现出性别特异性。

2）通过比较雌雄基因组中DNA片段的差异，寻找雌或雄基因组特有的片段。早期采用的分子标记技术如，AFLP、RAPD、SSR等。随着测序费用的不断降低，通过全基因组测序（WGS）、简化基因组测序（RAD-seq）等高通量测序技术大大加快了性别连锁标记和性别决定基因研究的步伐。

不再啰嗦，直接上干货……

相关文献解读

· 文献1[1]：

将测序reads分别和雌斑石鲷基因组、雄斑石鲷基因组进行比对，通过比较基因组分析，获得1-50bp的雄性特异性序列，这些序列只在雄鱼基因组中有reads覆盖，而在雌鱼基因组中没有reads覆盖。共检测到位于5个Contig的1967个雄性特异区域，然后根据测序深度（>10X）和重复度对这些候选区域进行过滤。随后，采用等位基因特异性PCR（allele-specific polymerase chain reaction，ASPCR）在12只雄鱼、12只雌鱼中对候选标记进行验证，最终获得一段18bp插入的雄性特异标记，该雄性特异性标记在另外98个来自不同斑石鲷种群的个体、以及繁殖季节的500条斑石鲷中也得到确认，即遗传性别鉴定和表型性别一致。

图1 斑石鲷雄性特异标记筛选流程

图2 通过三对引物对98条斑石鲷进行性别鉴定，雄斑石鲷有两条带，雌斑石鲷只有一条带，长带在雌、雄斑石鲷中都出现且是相同的，短带只在雄斑石鲷中出现。

· 文献2[2]：

首先，对3条雌鳜鱼和3条雄鳜鱼进行基因组de novo测序，分别对数据产出最高的1条雌鳜鱼和1条雄鳜鱼进行基因组组装，获得雌、雄鳜鱼基因组。然后，将另外2条雄鳜鱼和3条雌鳜鱼的测序reads和雄鳜鱼参考基因组进行比对，筛选2个雄性样本均覆盖、但3个雌性样本均没有覆盖的区域作为雄性特异标记，共计212个雄性特异序列。根据雄性特异序列设计引物，在4雄、4雌样品中进行第一轮验证后，获得8对候选引物；然后用8雄、8雌对8对候选引物进行第二轮验证；最后采用三对最佳引物对来自同一群体的85条鳜鱼和来自不同群体的64条鳜鱼进行第三轮验证，结果表明三对最佳引物鉴定性别的准确率为100%。

图3 鳜鱼性别特异标记筛选流程

图4 用三对雄性特异性引物（M46，M32，M39）对另外四个养殖鳜鱼群体中的八雌和八雄（共64条）进行性别鉴定，鉴定结果与它们的表型性别完全一致。

· 文献3[3]：

首先使用2b-RAD技术对5雄5雌共10尾鳙鱼进行测序，筛选雄性鳙鱼特有基因组序列。然后选用其中一尾雄性鳙鱼进行全基因组测序，基因组组装后，将筛选到的雄鱼特有序列与其进行比对，获得更长片段的雄鱼特有序列，以便设计引物。经PCR验证及扩大受试群体后的进一步实验，证实了该区段确实雄性鳙鱼特有，可稳定用于鳙鱼的性别鉴定。最后在白鲢鱼中也进行了检测，结果发现上述分子标记同样能稳定对白鲢鱼进行性别鉴定。

图5 鳙鱼性别特异标记筛选流程

图6 基于雄鳙鱼特异性序列设计三对引物对8雌和8雄进行PCR扩增和性别鉴定，扩增结果与性别表型吻合。

· 文献4[4]：

采用2b-RAD技术对中华绒鳌蟹2个亲本和120个F1子代进行测序，构建高密度遗传图谱。然后进行QTL定位和GWAS分析，二者的分析结果相互验证，均表明性别相关的标记位于一条连锁群上。最后，对不同发育阶段的中华绒鳌蟹进行转录组测序，将标记序列与转录组数据比对，获得候选性别决定基因。

图7 中华绒鳌蟹性别特异标记筛选流程

图8 中华绒螯蟹的性别连锁群，其中与性别相关的GWAS标记显示在雌性连锁群的黑框中，与性别相关的QTL标记显示在雌性和雄性连锁群的红框中，所有可能的性别标记都用灰色阴影表示。GWAS检测到的46个性别相关的标记的分离模式与方框内的1-3模式相符合。

关于青岛欧易

青岛欧易生物科技有限公司（简称“青岛欧易”）成立于2015年，为上海欧易生物医学科技有限公司的控股子公司。青岛欧易现拥有2b-RAD、MethylRAD、Super-GBS三项特色技术，其中2b-RAD技术于2019年被认定为青岛市“专精特新”技术。为使上述技术得到更好的推广应用，公司组建了高水平的专家顾问团队。其中，2b-RAD、MethylRAD技术发明人王师教授所在的海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室将为青岛欧易生物长期提供技术支持；Super-GBS技术发明人祁澎博士一直担任公司的技术顾问。青岛欧易成立至今，已与200多家单位合作，完成700多个简化基因组项目，涉及近200个物种，协助客户发表高水平SCI论文近200篇，其中分子标记开发相关文章15篇，涉及期刊有《New Phytologist》、《Elife》、《Heredity》、《DNA Research》、《Genes》等。

参考文献

1. Li M, Xu H, Zhou Q, et al. Isolation of a male-specific molecular marker and development of a genetic sex identification technique in spotted knifejaw (Oplegnathus punctatus). Marine Biotechnology, 2020, 22, 467-474.

2. Han C, Zhu Q, Lu H, et al. Screening and characterization of sex-specific markers developed by a simple NGS method in mandarin fish (Siniperca chuatsi). Aquaculture, 2020, 527, 1-7.

3. Liu H, Pang M, Yu X, et al. Sex-specific markers developed by next-generation sequencing confirmed an XX/XY sex determination system in bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis) and silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). DNA Research, 2018, 25, 257-264.

4. Cui Z, Hui M, Liu Y, et al. High-density linkage mapping aided by transcriptomics documents ZW sex determination system in the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis. Heredity, 2015, 115, 206-215.

END

青岛欧易 撰文