前言
空间转录组测序技术因其能够原位捕获细胞中表达的RNA，为探究不同组织空间位置下细胞分布及基因表达特征提供可能。此外，与传统的原位杂交技术相比，空间转录组测序通量高，优势显著，是继单细胞转录组测序技术之后，探究生物学问题的又一利器。
基本信息
样本类型：人、小鼠脑
技术类型：Spatial Transcriptomics，In situ Sequencing
发表期刊：Cell
影响因子：38.637
背景介绍
阿尔茨海默病是发生于老年和老年前期的神经系统疾病，主要表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害、抽象思维和计算能力损害、人格和行为改变等。目前阿尔茨海默病研究的一个中心问题是淀粉样斑块与神经退行性过程的关系，尽管在阿尔茨海默氏病（AD）的淀粉样斑块周围观察到复杂的炎症样变化，但对其特征的分子变化和细胞相互作用知之甚少。
研究结果
1. 技术路线
图1
作者分别选取3月龄（3m），6月龄（6m），12月龄（12m），18月龄（18m）的AppNL-G-F（AD模型）和 C57BL/6（正常模型）小鼠脑组织，利用冰冻切片技术获取每只小鼠的3张连续切片，中间的一张用来做ST，其他两张用来做免疫组化检测。
2. 成鼠脑的ST测序
图2
作者将每个冠状切面与Allen Mouse brain Atlas（Lein et al.，2006）定义的14个大脑解剖区域（Fig2B）进行比对分析，并将每个TD（Tissue domain）分配到其中一个区域。通过对有效spots进行降维聚类分析，进而比较不同区域及不同样本间基因表达的差异（Fig 2C-D）。
3. 基因表达与淀粉样蛋白（β-Amyloid，Aβ）累积的关系
图3
AppNL-G-F小鼠中的Aβ蛋白沉积开始于3个月左右（Fig3A）。采用TD中像素的Aβ荧光强度的标准差作为Aβ累积指数，从而区分Aβ轻度累积区和Aβ高度积累区，且这一结果与Aβ免疫染色结果一致（Fig3A-C），说明Aβ的累积从背侧向腹侧皮质、丘脑和海马体逐渐增多。
4. Aβ斑块诱导基因的鉴定
图4
作者通过WGCNA分析，发现plaque-induced genes (PIGs)模块在Aβ小鼠中显著富集，这个模块包含57个基因，这些基因在开始发生轻微上调，到12月份急剧上调，并在整个大脑中稳定表达（Fig4A-B）。此外，皮尔森相关性分析Aβ累积与PIGs的表达具有显著相关性（Fig4C），表明PIGs的表达随着Aβ在整个脑区的积累而逐渐增加。为了进一步确定PIGs的特征，作者将PIGs与疾病相关/活化反应相关的小胶质基因和炎性星形胶质相关进行维恩分析，发现其中36个PIGs未被定义为疾病相关的胶质基因（Fig4D）。此外作者发现人MIC1标记基因(Fig4E-F)的小鼠同源物在Aβ暴露中的基因表达发生改变。对小鼠的分析表明，人脑中的MIC1反应是对淀粉样斑块的多细胞协调反应的一部分，这种反应随时间的推移而演变。
5. PIGs模块的ISS分析
图5
为了实现对ST的空间分辨率，作者使用各细胞类型marker和PIGs的定制探针对18m的两个appNL-G-F和两个WT小鼠中进行原位测序（In Situ Sequencing，ISS）分析（Fig5A-C），通过荧光点数量化基因表达，并将Aβ累积周围的荧光点数分成5个组（ring1-ring5）（Fig5D）。进一步分析发现PIGs的54个基因，其中51个显著富集在ring1，而C1qb在ring1中显著缺失，与ST的结果一致（Fig5E）。为了研究PIG网络的细胞特征，作者开发了一种算法，通过计算5mm半径范围内的细胞类型标记基因的富集程度（不包括正在研究的点），将每个点分配一种细胞类型。以此来预测Aβ斑块中的细胞类型。(Fig5F-G)。结果发现，PIGs对Aβ的反应在很大程度上与小胶质细胞有关，星形胶质细胞在一定程度上也起到了重要作用(Fig5H)。
6. PIGs模块中小胶质细胞和星形胶质细胞基因的共表达分析
图6
为了分析 Aβ累积异常是否驱动不同细胞中PIGs的表达。作者对PIGs进行WGCNA分析，根据Aβ指数将所有ST分为5个部分，包括WT和AD的4个区域，作者发现，WT中PIGs模块的基因联系最低，随着Aβ累积增多，PIGs网络的相互联系更加密切（Fig6）。
7. OLIG模块对Aβ累积的时空响应
图7
通过WGCNA分析，作者还发现另一个高表达AD相关少突胶质细胞基因的模块OLIG，为了探究这个模块与Aβ累积的关系，作者从AD症小鼠中分离出Aβ累积的区域，发现3月时OLIG的表达与Aβ累积呈正相关，18月时呈负相关（Fig7A-B），且不同脑区也有所差异，如在纤维束(FB)、丘脑(TH)和下丘脑(HY)中存在显著的正相关，而在内嗅皮层（ENTI）中则存在显著的负相关（Fig7C-F）。最终作者证实，在轻度Aβ累积下，OLIG模块高表达，但在高密度Aβ积累下，OLIG表达减少。
8. 人脑中PIG和OLIG的可视化
图8
为了验证前面的发现，作者将PIG和OLIG的基因，与RNA-seq数据发现的人AD相关基因做交互分析，发现PIG中的45个基因，OLIG的42个基因与AD相关基因重叠。与预期的一样，PIG模块和OLIG模块基因分别在灰质和白质中被富集（Fig8A-B）。与ISS分析类似，作者分析PIG基因在AD患者和control中的表达，发现与对照相比APOE和ARPC1B在AD患者的小胶质细胞中显著表达，NPC2、S100A6、ITGB5、PRDX6和VSIR在AD患者星形胶质细胞中显著表达，提示AD患者疾病相关的胶质细胞激活（Fig8D）。此外，在OLIG中发现22个基因在Aβ累积部位中显著缺失（Fig8）。
研究结论
本文利用空间转录组学研究了在AD小鼠模型中，淀粉样斑块周围直径为100mm的组织域中发生的转录变化。发现了富含髓鞘和少突胶质细胞基因（OLIGs）的基因共表达网络的早期改变，而斑块诱导的基因（PIGs）的多细胞基因共表达网络涉及补体系统、氧化应激、溶酶体和炎症，在疾病的后期非常突出。此外作者通过对小鼠和人脑切片进行原位测序（ISS），证实了大多数观察到的细胞水平的变化。空间转录组学分析为探究AD和其他脑部疾病致病特征附近失调的细胞网络提供了可能。
参考文献
Chen WT, Lu A, Craessaerts K, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer's Disease. Cell. 2020;182(4):976-991.e19. doi:10.1016/j.cell.2020.06.038
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